---------------------------------------------------------------------
E številka       Specifično ime            NDV
                                           konzervansa na kg citrusov
                                           (cel sadež)
---------------------------------------------------------------------
E 230            Bifenil (difenil)         70 mg/kg
E 231            Ortofenil fenol           12 mg/kg izraženo
E 232            Na ortofenil fenol        kot
                                           ortofenil fenol(1)
---------------------------------------------------------------------

                                                                        Priloga 1

        POSTOPEK VZORČENJA CITRUSOV ZA NAMENE DOLOČANJA NDV KONZERVANSOV
 
    A) Vzorčenje
    1. Vzorčenje citrusov se izvaja z znanstvenimi metodami, ki zagotavljajo, da 
so vzorci značilni za serijo (lot), ki se analizira.
    2. Najmanjše število vzorcev na pošiljko:
    a) pakirano blago (zaboji, kartonske škatle in podobne enote pakiranja)
 
--------------------------------------------------------------------------
Število embalažnih enot                do 20   od 21    od 501    nad 1000
v seriji (lotu)                                do 500   do 1000
--------------------------------------------------------------------------
Minimalno število enot
pakiranja za vzorčenje                 1       2        3         4
Masa plodov za vzorčenje
na enoto pakiranja, izražena v kg      2       2        2         2
--------------------------------------------------------------------------
 
    b) blago v razsutem stanju
 
---------------------------------------------------------------------------
Masa serije (lota) v kg                do 20      od 21 do 500      nad 500
Masa sadja za vzorčenje v kg           2          4                 8
---------------------------------------------------------------------------
 
    3. »Serija (lot)« pomeni del pošiljke, ki je bila dostavljena istočasno in za 
katero vzorčevalec ve ali domneva, da ima enake značilnosti, kot so: sorta oziroma 
vrsta, stopnja zrelosti, vrsta enote pakiranja.
 
    B) Enota pakiranja in dostava vzorcev
    a) Vzorce je treba dati v nepredušne posode;
    b) Enote pakiranja je treba zapečatiti na mestu vzorčenja in označiti v skladu 
s postopkom izvajanja uradnega nadzora;
    c) Tako pakirane vzorce je treba nemudoma dostaviti v preskusne laboratorije.

                                                                         Priloga 2

          KVALITATIVNA ANALIZA OSTANKOV KONZERVANSOV V LUPINI CITRUSOV
 
 
    1. Namen in obseg
 
    V nadaljevanju opisana metoda omogoča zaznavanje prisotnosti ostankov 
bifenila, ortofenil fenola (OFF) ali natrijevega ortofenil fenola v lupini 
cirusov. Meja občutljivosti te metode, v absolutni vrednosti, je približno 5 (g za 
bifenil in 1 miligram za OFF ali natrijev ortofenil fenol, kar ustreza 5(g 
bifenila (5 ppm) in 1 miligramu OFF (1 ppm) v lupini 1 kilograma citrusov.
    Po obdelavi citrusov z zgoraj navedenimi konzervansi se naloženi ostanki 
najdejo predvsem v lupini sadeža. Kvantitativna analiza teh ostankov v celotnem 
sadežu je zato potrebna samo, če jih je mogoče najti v lupini.
 
 
    2. Princip
 
    Lupina se ekstrahira s pomočjo diklormetana v kisli sredini. Ekstrakt se 
koncentrira in loči s tankoplastno kromatografijo na silikagelu. Prisotnost 
bifenila, ortofenil fenola ali natrijevega ortofenil fenola se opazuje s 
fluorescenco in barvo.
 
 
    3. Reagenti
 
    – cikloheksan p.a.;
    – diklormetan p.a.;
    – klorovodikova kislina 25% (m/v);
    – silikagel GF 254, Merck ali enakovreden;
    – 0,5% raztopina 2,4,7-trinitrofluorenona (Fluka, B.D.H ali enakovreden) (TNF) 
v acetonu;
    – 0,1% raztopina 2,6-dibromo-benzokinon-4-kloroimida v etanolu (stabilen do 
enega tedna pri hranjenju v hladilniku);
    – koncentrirana raztopina amonijaka, gostota.: 0, 9;
    – standardna 1% raztopina čistega bifenila v cikloheksanu;
    – standardna 1% raztopina čistega ortofenil fenola v cikloheksanu.
 
 
    4. Oprema
 
    – mešalec;
    – 250 ml steklenica z brušenim steklenim spojem in hlajenim povratnim 
hladilnikom
    uparjalnik pod znižanim tlakom;
    – mikropipete;
    – naprava za tankoplastno kromatografijo s ploščami 20 x 20 cm;
    – U.V. ultravijolična svetilka (254 nm); intenziteta mora biti taka, da je 
viden madež 5 (g bifenila;
    – oprema za uprašenje reagentov;
    – sušilnik.
 
 
    5. Metoda
 
    a) Priprava vzorca in ekstrakcija
    Vse sadeže iz vzorca za preskušanje se prereže na polovico. Polovico vsakega 
kosa sadeža se shrani za kvanitativno določanje ostankov bifenila in/ali ortofenil 
fenola. Iz drugih polovic se vzame kose lupin, tako da se dobi približno 80 gramov 
vzorca. Te kose se seseklja in zdrobi v mešalcu ter prenese v 250 ml bučko; doda 
se 1 ml 25% klorovodikove kisline in 100 ml diklormetana. Mešanico se deset minut 
segreva pod povratnim hladilnikom. Po ohladitvi in spiranju hladilnika s približno 
5 ml diklormetana se mešanico filtrira skozi naguban filter. Raztopino se prenese 
v uparjalnik in doda nekaj poroznih zrn. Raztopino se koncentrira pri znižanem 
tlaku pri temperaturi 60 oC do končnega volumna približno 10 ml. Če se uporablja 
rotacijski uparjalnik, mora biti steklenica pritrjena, da se izognemo izgubi 
bifenila z nastankom tanke plasti izdelka na zgornji steni bučke.
 
    b) Kromatografija
    30 gramov silikagela in 60 ml vode se prenese v mešalec in meša eno minuto. 
Mešanico se zatem vlije na 5 kromatografskih plošč in razprostre, da se dobi 
približno 0,250 mm debelo plast. Plošče, prekrite s to plastjo, se za 15 minut 
izpostavi toku vročega zraka in nato postavi v sušilnik, kjer se jih segreva 
trideset minut pri temperaturi 110 oC.
    Po ohladitvi se vsako ploščo z vzporednimi črtami, ki prodirajo skozi plast do 
površine plošče, razdeli na 2 cm široke trakove. Na vsak trak se kane 50 (l 
ekstrakta za analizo kot vrsto kapljic blizu skupaj, približno 1,5 cm od roba. 
Najmanj en trak se ohrani za kontrole, ki se sestojijo iz nanosa 1(l (to je 10 (g) 
standardnih raztopin bifenila in ortofenil fenola.
    Kromatografske plošče se razvijejo v mešanici cikloheksana in diklormetana 
(25:95) v posodah, predhodno obloženih s filtrirnim papirjem.
 
    c) Zaznavanje in identifikacija
    Prisotnost bifenila in ortofenila se pokaže kot pojav madežev v ultravijolični 
svetlobi (254 nm). Natrijev ortofenil fenol se med ekstrakcijo v kislem mediju 
pretvori v ortofenil fenol in njegove prisotnosti se zato ne more razlikovati od 
prisotnosti ortofenil fenola. Izdelki se identificirajo na naslednji način:
    – bifenil daje rumen madež pri dnevni svetlobi, če se ga poškropi z raztopino 
TNF;
    – Ortofenil fenol daje moder madež, če se ga poškropi z raztopino 2,6-
dibromobentokinon-4-kloramida, hitro prevede skozi tok vročega zraka in izpostavi 
z amonijakom nasičeni atmosferi.

                                                                         Priloga 3

               KVANTITATIVNA ANALIZA OSTANKOV BIFENILA V CITRUSIH
 
 
    1. Namen in obseg
 
    Spodaj opisana metoda daje kvantitativno analizo ostankov bifenila v citrusih 
(cel sadež). Točnost metode je (10% vsebnosti bifenila, ki je višja od 10 
miligramov na kilogram sadja (10 ppm).
 
 
    2. Princip
 
    Po destilaciji v kislem mediju in ekstrakciji s cikloheksanom ekstrakt 
kromatografiramo na tenki plasti na silikagelu. Kromatogram se razvije, bifenil se 
eluira in določi spektrofotometrično pri 248 nm.
 
 
    3. Reagenti
 
    – raztopina koncentrirane žveplove kisline;
    – emulzija proti penjenju na podlagi silikona;
    – cikloheksan p.a.;
    – heksan p.a.;
    – etanol p.a.;
    – brezvodni natrijev sulfat;
    – silikagel GF 254, Merck ali enakovreden;
    – standardna 1% raztopina čistega bifenila v cikloheksanu: razredči se s 
cikloheksanom, da se dobijo naslednje tri raztopine:
    a) 0,6 (g/(l;
    b) 1(g/(l;
    c) 1,4 (g/(l.
 
 
    4. Oprema
 
    – mešalnik (kapaciteta 1 l);
    – 2-litrska bučka za destilacijo z modificiranim separatorjem vrste 
Clevenger(**) in hlajenim povratnim hladilnikom;
    – 10 ml merilna bučka;
    – 50 (l mikropipete;
    – naprava za tankoslojno kromatografijo s ploščami 20 x 20 cm;
    – sušilnik;
    – centrifuga s 15 ml konusnimi epruvetami;
    – UV spektrofotometer.
 
 
    5. Metoda
 
    a) Priprava vzorca in ekstrakcija
    Vse sadje v vzorcu za preskušanje se prereže na polovico.
    Polovico vsakega sadeža se shrani za kvalitativno analizo na ostanke bifenila, 
OFF ali natrijevega ortofenil fenola. Druge polovice se skupaj razreže v mlinu ali 
zdrobi, dokler se ne dobi homogene mešanice. Od tega se vzame najmanj dva 200 
gramska podvzorca za analizo na naslednji način. Vsak podvzorec se prenese v 
mešalec s 100 ml vode in nekaj sekund meša pri majhni hitrosti. Doda se vodo, 
dokler volumen mešanice ne doseže treh četrtin kapacitete mešalnika, nato se 
mešanico pet minut meša pri polni hitrosti. Tako dobljeni pire se prenese v 2-
litrsko bučko za destilacijo. Mešalnik se spere z vodo in vodo od spiranja doda 
vsebini bučke. (Skupna količina vode, ki se uporabi za mešanje in spiranje, je 1 
l). Mešanici se doda 2 ml žveplove kisline, 1 ml emulzije proti penjenju in nekaj 
poroznih zrn. Bučko se spoji s separatorjem in povratnim hladilnikom. V separator 
se doliva destilirano vodo, dokler nivo vode ni precej nad spodnjo ročico stranske 
povratne cevi, nato se doda 7 ml cikloheksana. Destilira se približno dve uri. 
Vsebino iz separatorja se lovi v 10 ml merilno bučko, separator se spere s 
približno 1,5 ml cikloheksana in spirine doda k vsebini bučke, ki se jo nato 
dopolni s cikloheksanom. Nazadnje se doda malo brezvodnega natrijevega sulfata in 
mešanico pretresemo.
 
    b) Kromatografija
    V mešalnik se prenese 30 gramov silikagela in 60 ml vode ter meša eno minuto. 
Mešanico se nato vlije na 5 kromatografskih plošč in razprostre, da se dobi 
približno 0,250 mm debelo plast. Plošče, prekrite s to plastjo, se za petnajst 
minut izpostavi toku vročega zraka in nato postavi v sušilnik, kjer se jih segreva 
trideset minut pri temperaturi 110 oC. Vsako ploščo se po hlajenju z vzporednimi 
črtami, ki prodirajo skozi plast do površine plošče, razdeli na 4,5 cm široke 
trakove. Na vsak trak se kane 50 (l ekstrakta za analizo kot vrsto kapljic blizu 
skupaj, približno 1,5 cm od roba plošče. Na vsakega od ostalih treh trakov se na 
enak način nanese 50 (l standardnih raztopin iz a), b) in c) točk, ki ustrezajo 
vrednostim 30, 50 in 70 (l bifenila.
    Če se izvajajo analizo v seriji, ni potrebno na vsako ploščo dodati 
standardnih raztopin, standardno krivuljo pa se lahko pripravi iz povprečja 
vrednosti, dobljenih iz najmanj petih plošč z enakimi standardnimi množinami.
 
    c) Razvijanje kromatogramov in eluiranje
    Kromatograme se razvije s heksanom do višine 17 cm v posodah, ki se jih 
predhodno obložili s filtrirnim papirjem. Plošče se posušijo na zraku. Področja, 
na katerih je lokaliziran bifenil, se opazijo v ultravijolični svetlobi (254 nm) 
in se jih označi kot pravokotnike enakih površin.
    Tako označena področja se z lopatico takoj postrga do čistega, skozi vso 
debelino nosilne plasti. Iz te postrgane plasti se ekstrahira bifenil z 10 ml 
etanola deset minut, ob večkratnem stresanju. Mešanico se prenese v epruvete za 
centirfugiranje in pet minut centrifugira pri 2500 obratih na minuto.
    Z enako metodo se vzame področje kontrolnega vzorca. Če se analize izvaja 
serijsko, se kontrolno področje vzame iz neuporabljenega traku plošče; če se 
analize opravljajo posamično, se vzame iz enega od trakov, ki vsebuje standardno 
raztopino, ki se nahaja pod področjem, ki vsebuje bifenil.
 
    d) Spektrofotometrično določanje
    Tekočino, ki plava na površju, se dekantira v kivete spektrofotometra in pri 
248 določi ekstinkcijo ter primerja s kontrolnim ekstraktom iz kromatografskega 
področja, ki ne vsebuje bifenila.
 
 
    6. Izračun rezultatov
 
    Standardno krivuljo se pripravi tako, da v diagram nanaša vrednosti bifenila 
30, 50 in 70 (g v odvisnosti od ekstincije, določene na spektrofotometru. Dobi se 
premico, ki poteka skozi izhodišče. Ta diagram omogoča odčitavanje vsebnosti 
bifenila v vzorcih v ppm neposredno iz vrednosti ekstinkcij njihovih ekstraktov.

                                                                         Priloga 4

                KVANTITATIVNA ANALIZA OSTANKOV ORTOFENIL FENOLA
                   IN NATRIJEVEGA ORTOFENIL FENOLA V CITRUSIH
 
 
    1. Namen in obseg
 
    Spodaj opisana metoda omogoča kvantitativno analizo ostankov ortofenil fenola 
(OFF) in natrijevega ortofenil fenola v citrusih (celi sadeži). Metoda daje 
rezultate, ki so za vsebnost OFF ali natrijevega ortofenil fenola reda velikosti 
12 ppm prenizki za približno 10 in 20%.
 
 
    2. Princip
 
    Po destilaciji v kislem mediju in ekstrakciji z di-izopentil etrom se ekstrakt 
prečisti in obdela z raztopino 4-amino-2,3-dimetil-1-fenil-3-pirazolin5-ena (= 4-
aminoantipirin). Razvije se rdeča barva, katere intenziteto se meri s 
spektrofotometrijo pri 510 nm.
 
 
    3. Reagenti
 
    – 70% ortofosforjeva kislina;
    – emulzija proti penjenju na podlagi silikona;
    – di-izopentil eter p.a.;
    – prečiščeni cikloheksan; trikrat se strese s 4% raztopino natrijevega 
hidroksida in trikrat spere z destilirano vodo;
    – 4% raztopina natrijevega hidroksida;
    – puferna raztopina, pH 10,4: v 2-litrsko merilno bučko se prenese 6,64 grama 
borove kisline, 8,00 gramov kalijevega klorida in 93,1 ml raztopine M natrijevega 
hidroksida: premeša se in napolni z destilirano vodo do oznake;
    – reagent I: 1 gram 4-amino-2,3-dimetil-1-fenil-3-pirazolin5-ena (= 4-
aminoantitipirin) se raztopi v 100 ml destilirane vode;
    – reagent II: 2 grama kalijevega ferocianida se raztopi v 100 ml destilirane 
vode;
    Reaganta I in II se mora hraniti v rjavih stekleničkah, stabilna pa sta samo 
približno štirinajst dni;
    – silikagel;
    – standardna raztopina: 10 miligramov čiste OFF raztopimo v 1 ml 0,1 M NaOH; 
razredčimo na 100 ml z 0,2 M raztopino natrijevega borata (1 ml = 100 (g). Za 
standardno raztopino razredčimo v razmerju 1: 10 s puferno raztopino.
 
 
    4. Oprema
 
    – mlin za sekljanje ali drobljenje;
    – mešalnik;
    –1-litrska bučka za destilacijo z modificiranim separatorjem vrste 
Clevenger(**) in povratnim hladilnikom;
    – infra-rdeča kopel;
    – 200 ml lij ločnik;
    – graduirani valji 25 in 100 ml;
    – merilne bučke 25 in 100 ml;
    – 1 do 10 ml pipete;
    – 0,5 ml graduirane pipete;
    – spektrofotometer s 5 cm kivetami.
 
 
    5. Metoda
 
    Vse sadje v vzorcu se prereže na polovico. Polovico vsakega sadeža se shrani 
za kvalitativno analizo na ostanke bifenila, OFF ali natrijevega ortofenil fenola. 
Druge polovice se združi in razreže v mlinu ali zdrobi, dokler se ne dobi homogene 
mešanice. Od te mešanice se odvzame najmanj dva 250 gramska podvzorca za analizo 
na naslednji način.
    Vsak podvzorec se prenese v mešalnik skupaj s 500 ml vode in meša, dokler se 
ne dobi zelo fine homogene mešanice, v kateri ni več mogoče zaznati mastnih 
delcev. 150 do 300 gramov vzorca pireja, odvisno od domnevne vsebnosti OFF, se 
prenese v 1-litrsko bučko za destilacijo s količino vode, ki zadošča, da se 
mešanico v bučki razredči do 500 gramov. Potem, ko se je dodalo 10 ml 70% 
ortofosforne kisline, nekaj poroznih zrn in 0,5 ml emulzije proti penjenju, se 
spoji bučko s separatorjem in povratnim hladilnikom. V separator se doda 10 ml di-
isopentil etra in zmerno segreva na infra-rdeči kopeli, pri čemer pire ne sme 
zavreti ali se peniti. Po destilaciji, ki traja približno šest ur, se vsebina 
separatorja prelije v 200 ml lij ločnik ter spere separator in hladilnik s 60 ml 
cikloheksana ter nato še s 60 ml vode.Tekočine od spiranja se združi z vsebino v 
liju ločniku. Mešanico se močno stresa in, ko se fazi ločita, se vodno fazo 
zavrže.
    Za ekstrakcijo OFF, se organsko fazo močno petkrat pretrese, vsakokrat po tri 
minute, z 10 ml 4% natrijevega hidroksida. Alkalne raztopine se združi, 
nevtralizira do pH 9-10 z otorfosforjevo kislino v prisotnosti fenolftaleinskega 
papirja in razredči do 100 ml z destilirano vodo. Doda se ščepec silikagela, da se 
razbistri raztopina, ki je videti nekoliko motna. Raztopino se nato pretrese in 
filtrira skozi suh, fino-zrnat filter. Ker se obarvanje razvije z maksimalno 
točnostjo in natančnostjo pri količin OFF med 10 in 70 (g, se odpipetira alikvot 
vzorca med 0,5 do 10 ml raztopine, ob upoštevanju količin OFF, ki se jih lahko 
pričakuje. Vzorec se prenese v 25 ml merilno bučko; doda se 0,5 ml reagenta I, 10 
ml puferne raztopine in nato 0,5 ml reagenta II. Mešanici se doda puferno 
raztopino do oznake in močno pretrese.
    Po petih minutah s spektrofotometrom se izmeri ekstinkcijo rdečega obarvanja 
pri 510 nm proti raztopini, ki ne vsebuje ekstrakta. Barva v tridesetih minutah ne 
izgubi intenzitete. Ovrednoti se iz standardne krivulje, ki se jo pripravi pod 
enakimi pogoji z uporabo standardne raztopine OFF.
 
 
    6. Opažanja
 
    Za vsako analizo se priporoča, da se spektrofotometrično določanje opravi z 
dvakratno ponovitvijo z različnimi volumni nevtraliziranega alkalnega ekstrakta.
    Neobdelani citrusi dajejo s to metodo »slepo« vrednost: do 0,5 ppm za 
pomaranče in 0,8 ppm za limone.
 
    (**)slika modificiranega separatorja vrste CLEVENGER