Priloga I: Lista odvzemnih mest

Priloga II: Količina vzorcev živil in kmetijskih proizvodov rastlinskega izvora

Priloga III: Količina vzorcev živil in kmetijskih proizvodov živalskega izvora

Priloga IV: Zapisnik o vzorcu za monitoring

PRILOGA V (1. del)


POSTOPKI ZA NADZOR KAKOVOSTI PRI ANALIZI OSTANKOV PESTICIDOV

Uvod

1. Podatke o ostankih pesticidov lahko uporabimo za preverjanje
skladnosti z najvišjimi dovoljenimi količinami ostankov (maximum
residue level - MRL), podporo ukrepanju ali ocenitvi
izpostavljenosti potrošnikov pesticidom. Analiza ostankov je izziv
in primerni postopki nadzora kakovosti so bistveni, da bi
prikazali veljavnost rezultatov brez nepotrebnih stroškov. Ostanke
pesticidov moramo pravilno identificirati, da bi ugotovili njihovo
količino. Kjer je znanje o količini ostankov pomembno, bodo
veljale strožje zahteve iz tega dokumenta. Manj stroge alternative
uporabimo, če je točna vsebnost ostankov relativno nepomembna -
npr. če je dovolj podatek, da so ostanki v okviru najvišjih
dovoljenih količin. Priložen je slovarček izrazov.

Načela delovanja

2. Laboratorijski postopki morajo biti izvedeni v okviru uradno
priznanega akreditacijskega programa, ki je v skladu s SIST EN
45001.

3. Laboratorij mora sodelovati v medlaboratorijskih primerjalnih
preskusih, kot jih organizirajo Evropska komisija, FAPAS in CHEK.
Kjer so rezultati primerjalnih preskusov (z-scores), moramo
problem odpraviti pred nadaljnjimi analizami vsebnosti pesticidov.

4. Za dosego kvantitativnih rezultatov morajo biti odločilne mase
in prostornine, merjene z opremo, katere natančnost je med ±2%,
raje med ±1%. Oprema za merjenje mase in prostornine mora biti
umerjena, vzdrževana in uporabljana v skladu z navodili
proizvajalca. Podoben postopek moramo uporabiti za spektrometrično
opremo, ki zahteva umerjanje valovnih dolžin, razmerje med maso in
nabojem, ipd. Kolikor je mogoče, naj analize obsegajo komponente,
določene v mejah MRL.

Vzorčenje, prevoz, obdelava in shranjevanje vzorcev

Vzorčenje

5. Vzorce moramo jemati v skladu z uredbo o monitoringu pesticidov
v živilih in kmetijskih proizvodih1, ali v skladu s predpisi, ki
urejajo to področje. Kjer je naključno jemanje primarnih vzorcev
iz celote neustrezno, moramo zapisati metodo vzorčenja.

Prevoz vzorcev

6. Vzorce moramo pripeljati v laboratorij v čistih posodah in
robustni embalaži. Polietilenske vrečke, ki so po potrebi
prepihane, so sprejemljive za večino vzorcev. Za vzorce, kjer je
potrebna analiza ostankov fumigantov, moramo uporabiti vrečke z
nizko prepustnostjo (npr. najlonski film). Vzorcev proizvodov, ki
so že pakirani za maloprodajo, naj ne bi jemali iz njihove
embalaže pred prevozom. Zelo krhko ali pokvarljivo blago (npr.
zrele maline) lahko zamrznemo, da se izognemo kvarjenju, in šele
nato prevažamo v "suhem ledu" ali podobnem, da se izognemo
odmrznitvi med prevozom. Podobno moramo vzorce blaga, ki je bilo
zamrznjeno ob vzorčenju, prevažati zamrznjene. Vzorci proizvodov,
ki bi se lahko poškodovali ob ohladitvi (npr. banane) morajo biti
zaščiteni tako pred visoko kot pred nizko temperaturo. Vzorce
moramo označiti jasno in neizbrisno s pomočjo nalepk, ki se jih ne
da odstraniti nenamerno. Za označevanje vrečk z vzorci, ki jih
moramo analizirati na ostanke fumigantov, se moramo izogibati
uporabi markirnih svinčnikov, ki vsebujejo organska topila. Hiter
prevoz v laboratorij, po možnosti v enem dnevu, je bistven za
večino vzorcev. Pokvarljivi, krhki ali težki vzorci, ki se lahko
med prevozom poškodujejo, zahtevajo posebno skrb pri pakiranju.
Stanje vzorcev, ki pridejo v laboratorij, mora biti približno
takšno, kot je sprejemljivo za kupca, sicer se vzorci običajno
smatrajo neprimerni za analizo.

Obdelava vzorcev za analizo

7. Laboratorij mora ob sprejemu dati vsakemu vzorcu enotno
razpoznavno oznako.

8. Obdelava vzorcev in jemanje podvzorcev mora biti izvedeno
preden se vzorci vidno pokvarijo (spremenijo). Vzorce iz konzerv,
suhe ali podobno obdelane vzorce moramo analizirati v času do
poteka roka uporabe, razen če so vzorci globoko zamrznjeni.

9. Obdelava vzorcev in postopki shranjevanja morajo biti takšni,
da nimajo bistvenega učinka na merjenje ostankov pesticidov.
Vzorci morajo biti homogenizirani, zdrobljeni in/ali zmešani,
preden odvzamemo dele za analizo. V primerih, ko se neobstojni
ostanki lahko sicer izgubijo v tem procesu, moramo vzorce zdrobiti
v zmrznjenem stanju (npr. v "suhem ledu" ali podobnem). Če vemo,
da drobljenje vpliva na ostanke (npr. ditiokarbamati ali
fumiganti) in ni praktičnih alternativnih postopkov, lahko del za
analizo predstavljajo cele enote proizvodov ali deli, odvzeti od
celih enot. Če je vzorec za analizo sestavljen iz malo enot ali
segmentov, kot tak ni analitsko reprezentativen, moramo
analizirati dodatne dele od začetka, da bi tako dobili bolj
reprezentativno srednjo vrednost. Vse analize naj bi opravili v
najkrajšem možnem času, da tako čim bolj zmanjšamo potrebo po
shranjevanju vzorcev. Analize ostankov zelo neobstojnih ali lahko
hlapnih pesticidov moramo opraviti na dan prejema vzorca.

Standardi za pesticide, umeritvene raztopine, ipd.

Identiteta in čistost standardov

10. Čistost referenčnih standardov (ki vključujejo pesticide,
njihove metabolite, derivate ali produkte razgradnje) in internih
standardov mora biti znana, ko je to mogoče. Ob sprejemu morajo
biti standardi datirani, dobiti morajo enotno razpoznavno oznako
in dodeljen mora biti rok uporabnosti. Naveden rok uporabnosti se
lahko razlikuje od roka uporabnosti, ki ga je podal dobavitelj
referenčnega standarda, če je to primerno za pesticid v
uporabljenih pogojih shranjevanja. Pri certificiranih standardih
bi bilo dobro, pri necertificiranih standardih pa moramo nujno
preveriti identiteto in (približno) čistost s kromatografijo,
infrardečo spektrofotometrijo, masno spektrometrijo (MS) ali
spektrometrijo z nuklearno magnetno resonanco. Kolikor je mogoče,
naj se referenčni spekter, ki ga uporabimo v ta namen, ujema s
kemijsko strukturo preiskovane spojine. Po dodeljenem roku uporabe
lahko obdržimo referenčne standarde, če se pokaže, da je čistost
sprejemljiva, moramo pa določiti novi rok uporabnosti. Drugače jih
moramo zamenjati. Relativno čistost novih in starih referenčnih
standardov istega pesticida lahko določimo s primerjanjem odzivov
detektorja, ki jih dobimo iz istočasnih, sveže pripravljenih
razredčitev starega in novega materiala (glej tudi 15. odstavek).
Razlike med starimi in novimi referenčnimi standardi, ki jih ne
moremo pripisati razlikam v čistosti, moramo preučiti in na novo
določiti dolžino in/ali pogoje shranjevanja, če je to potrebno.

11. Kromatografski odziv standarda mora dokazano pripadati
preiskovani spojini, kar po možnosti potrdimo z MS. Kjer je
ugotovljena spojina pirolizni produkt, ki je tudi metabolit
pesticida2, moramo uporabiti alternativni detekcijski sistem, če
metabolit ni vključen v opredelitev MRL.

Shranjevanje standardov

12. Če ustreza, lahko referenčne standarde shranjujemo v njihovih
prvotnih posodah, vendar pokrovčki ne smejo biti iz gume. Če se
standard vidno spremeni med hranjenjem, ga ne smemo uporabiti, ne
da bi poprej preverili čistost, razen če je sprememba posledica
zmrzovanja in taljenja. Standarde pesticidov moramo shranjevati po
navodilih proizvajalca (kjer so le ta podana), da čim bolj
zmanjšamo razpadanje. Na splošno velja, da je shranjevanje pri
nizkih temperaturah (hladilnik ali zamrzovalnik) v temnem prostoru
zadovoljivo. Posode morajo biti zatesnjene, da preprečimo vdor
vlage, kar je zlasti možno med segrevanjem na sobno temperaturo.


Priprava, uporaba in shranjevanje standardnih raztopin in
suspenzij preiskovanih spojin

13. Priprava raztopin pesticida (ali trdnih razredčenj) zahteva
veliko pozornost pri podrobnostih. Zapisati moramo identiteto in
maso (ali prostornino, za močno hlapne spojine) referenčnega
standarda, vrsto topila (ali drugega sredstva za razredčevanje),
ki ga uporabimo, in umerjanje prostornine merilnih bučk in pipet,
ki jih uporabimo. Amorfne trdne spojine moramo pred tehtanjem
homogenizirati. Začetne (osnovne) in nadaljnje (delovne)
razredčene mešanice moramo posebno označiti, opremiti s trajnimi
etiketami in popraviti koncentracije glede na čistost referenčnega
standarda (kjer je ta zanesljiva). Posameznih alikvotov raztopin,
uporabljanih za umerjanje, ni treba posebej podajati, vendar
moramo zapisati njihov izvor in metodo priprave.

14. Pesticidi ne smejo reagirati s topilom/topili, ki jih
uporabimo za pripravo raztopin, vendar pa morajo imeti v njih
ustrezno topnost. Topila morajo biti primerna za metodo analize in
združljiva s sistemom določanja, ki ga uporabljamo. Adsorpciji na
površino posode, zlasti ionskih pesticidov, se moramo izogniti z
dodajanjem kisline, silanizacijo steklovine ali z uporabo
primernih plastičnih posod. Vendar takšni ukrepi ne smejo motiti
detekcije pesticidov. Odtehtati moramo najmanj ca. 10 mg
referenčnega standarda pesticida, če je mogoče neposredno v
merilno bučko. Kot druga možnost lahko stehtamo pesticid v
predhodno stehtani (ali tarirani) posodi in ga kvantitativno
prenesemo tako, da ga speremo s topilom v volumetrično steklenico.
Hlapne tekoče pesticide dodajamo s tehtanjem ali volumetrično (če
je znana gostota) neposredno v manj hlapno topilo v volumetrični
steklenici. Plinske fumigante lahko dodamo v topilo v obliki
mehurčkov in stehtamo preneseno maso, ali pa naredimo razredčitve
s plinom (npr. s plinotesno brizgalko). V tem primeru mešanica ne
sme priti v stik z reaktivnimi kovinami.

15. Na raztopine pesticidov (ali razredčitve v trdni fazi) moramo
zapisati dodeljene roke uporabnosti, po katerih jih moramo
običajno zavreči. Na novo pripravljene osnovne raztopine moramo
razredčiti (če je potrebno, v ekstraktu matriksa) in jih
primerjati s tistimi, ki jih bomo zavrgli. Če povprečen odziv
detektorja pokaže, da se nova raztopina razlikuje od predhodne3 za
več kot ±5%, moramo točnost nove raztopine preveriti z novo
pripravljeno raztopino. Število določitev, zahtevanih za to
primerjavo, je odvisno od natančnosti uporabljenega detekcijskega
sistema. Če je odziv starega standarda potrjeno za >5% manjši kot
odziv novega standarda, moramo skrajšati čas shranjevanja raztopin
ali izboljšati pogoje njihovega shranjevanja. Če se odzivi starih
in novih standardov ne razlikujejo veliko, lahko razmislimo o
daljšem času shranjevanja. Vodne suspenzije ditiokarbamatov in
raztopine (ali plinske razredčitve) močno hlapnih fumigantov
moramo pripraviti sveže. Primerjava med novimi in starimi
standardi ni primerna. Veljavnost takšnega standarda lahko
primerjamo s sveže in neodvisno pripravljeni standardi.

16. Na odziv nekaterih detekcijskih sistemov (npr. GC, LC-MS,
ELISA) za določene pesticide lahko vpliva prisotnost
koekstrahiranih spojin iz vzorca. Te "vplive matriksa" lahko
opažamo kot povečane ali zmanjšane odzive v primerjavi s tistimi,
ki so bili izmerjeni v umeritvenih ali čistih raztopinah standarda
v topilu. Na porazdelitev pri "head space" analizah in pri SPME
tudi pogosto vplivajo komponente iz vzorcev. Vplivi v obliki
povečanja ali zmanjšanja GC odziva lahko odražajo povečanje ali
zmanjšanje učinkovitosti prehoda pesticida skozi injektor, če ga
primerjamo s prehodom le v topilu. Vplivi na odziv MS lahko
nastanejo z istočasnim izločanjem komponent matriksa, ki vplivajo
na učinkovitost ionizacije ali zbiranja ionov. Prisotnost ali
odsotnost takšnih vplivov lahko pokažemo s primerjavo odziva
detektorja na preiskovano spojino v raztopini samega topila in v
ekstraktu ustreznega matriksa. Vplivi matriksa se lahko močno
spreminjajo in so nepredvidljivi v svojem pojavljanju; začeten
prikaz merljivega učinka ne pomeni, da se položaj v nadaljevanju
ne bo spremenil. Bolj zanesljivo umeritev lahko dobimo, če
pripravimo standardne raztopine v ekstraktu ustreznega matriksa.
"Koncentracija matriksa", ki jo uporabljamo, mora biti enaka za
vse analize iste serije. Vzorce, za katere vemo, da ne vsebujejo
merljivih ostankov ali motečih spojin (npr. slepi vzorci), lahko
uporabimo za pripravo umeritvenih raztopin v ustreznem ekstraktu
matriksa ipd. Ekstrakte slepih vzorcev, ki jih potrebujemo v ta
namen, lahko najprimerneje pripravimo med ekstrakcijo serije
vzorcev. Te ekstrakte slepih vzorcev lahko analiziramo tudi brez
dodatka pesticidov, da pokažemo, ali je prišlo do onesnaženja med
ekstrakcijo in čiščenjem, in ali odzivi detektorja na komponente
matriksa motijo določitev preiskovane spojine. Umeritvene
raztopine, pripravljene v ekstraktu ustreznega matriksa in/ali
umeritvene raztopine, ki so pripravljene iz mešanice pesticidov,
so lahko manj stabilne kot raztopine posameznih pesticidov v
čistem topilu.

17. Raztopin ne smemo izpostavljati neposredni sončni svetlobi in
moramo jih hraniti pri nizki temperaturi v temnem prostoru - v
hladilniku ali zamrzovalniku, ter zatesnjene, da preprečimo izgubo
topila ali dostop vode. Raztopine, ki smo jih vzeli iz
skladiščnega prostora z nizko temperaturo, moramo segreti do sobne
temperature in ponovno premešati pred uporabo.

18. Če se za pripravo umeritvenih raztopin in ekstraktov ne
uporablja internega standarda, nekontrolirane izgube topila zaradi
izparevanja niso sprejemljive. Izgube topila iz majhnih količin je
težko kontrolirati. V primeru, da ne uporabljamo internih
standardov, moramo paziti, da se izognemo izparevanju. Kjer
uporabimo interni standard, moramo kar najbolj zmanjšati izgube
zaradi izparevanja, da se izognemo vplivu učinkov matriksa (glej
16. odstavek). Zamaški s tesnili so zlasti podvrženi izgubam
zaradi izparevanja (poleg tega, da so vir onesnaženja) in jih
moramo po predrtju čim prej zamenjati, če hočemo obdržati
ekstrakte.

Ekstrakcija in koncentriranje

Pogoji in učinkovitost ekstrakcije

19. Odmerke vzorca za analizo moramo pred ali med ekstrakcijo
popolnoma razdrobiti, da povečamo učinkovitost ekstrakcije, razen
kjer smo prikazali, da zaradi narave procesa (npr. ekstrakcija s
superkritično tekočino (SFE) določenih tipov vzorcev) razdrobitev
ni potrebna. Izogibati se moramo premočnemu segrevanju med
ekstrakcijo, da zmanjšamo izgube topila ali pesticida.
Temperaturo, pH, itd. moramo nadzorovati, če vemo, da vplivajo na
učinkovitost ekstrakcije in/ali stabilnost pesticidov.

20. Kjer ne nameravamo izvesti popolne ekstrakcije ostanka iz
vzorca za analizo in vzamemo le en alikvot ekstrakta iz
ekstrakcijske mešanice, moramo izmeriti prostornino topila, ki smo
ga prvotno dodali, do ±1% natančno. Izgubi topila zaradi
izparevanja pred odvzemom odmerka ekstrakta se moramo izogniti ali
pa jo izmeriti (po masi ali z dodatkom internega standarda). Kjer
pri tem tipu ekstrakcije prihaja do izgube topila nad 1%, moramo
rutinsko meriti izgube.

Koncentracija ekstrakta in redčenje na določeno prostornino

21. Velika skrbnost je potrebna v primerih, ko moramo ekstrakt
odpareti do suhega, saj lahko tako s površine izgubimo sledove
mnogih pesticidov. Kot zadrževalec lahko uporabimo majhno količino
topila z visokim vreliščem. Temperatura izparevanja naj bo čim
nižja. Penjenju in močnemu vretju ekstraktov ali razprševanju
kapljic se moramo izogibati. Tok suhega dušika ali centrifugalno
izparevanje sta običajno boljša kot uporaba zračnega toka za
izparevanje manjših količin, saj bo zrak prej privedel do
oksidacije ali vdora vode in drugih onesnaževalcev.

22. Kjer moramo pripraviti ekstrakte za določeno prostornino,
moramo uporabljati točno umerjene stekleničke s kapaciteto najmanj
1 ml. Kjer suhe ekstrakte raztopimo v določeni prostornini topila
iz brizgalke, mora imeti topilo dovolj visoko vrelišče, da ne
pride do nadaljnjega izparevanja. Kjer končna prostornina topila
ni merjena neposredno, moramo dodati določeno maso internega
standarda, da zagotovimo merjenje prostornine; zlasti to velja za
prostornine manjše od 1ml.

23. Stabilnost pesticidov v ekstraktih lahko močno niha, glede na
pesticid in lastnosti ekstrakta. Čeprav je shranjevanje ekstraktov
v hladilniku ali zamrzovalniku lahko dobro, je dnevna izguba pri
temperaturi avtomatskega injektorja, pritrjenega na GC, lahko
enaka mesečni izgubi shranjevanja v globoko zamrznjenem stanju.
Stabilnost pesticidov v ekstraktih moramo raziskati med validacijo
metode.

Onesnaženje in interference

Onesnaženje

24. Vzorce moramo ločiti med seboj in od drugih virov
potencialnega onesnaženja med prevozom v laboratorij in med
shranjevanjem v laboratoriju. To je zlasti pomembno pri
površinskih ali praškastih ostankih ali pri lahko hlapnih
pesticidih. Vzorce, v katerih bi utegnili biti takšni ostanki,
moramo dvojno zatesniti s polietilenskimi ali najlonskimi vrečkami
ter prevažati in obdelovati ločeno. Če so ukrepi za zatiranje
škodljivcev v laboratoriju ali blizu njega nujni, morajo biti
omejeni na uporabo proizvodov, kateri ne bodo analizirani kot
ostanki pesticidov.

25. Topila (tudi vodo), reagente, filtrirne pripomočke idr. moramo
preveriti glede možnih interferenčnih problemov. Topila, ki jih
uporabljamo za ugotavljanje ostankov fumigantov, so lahko posebej
problematična, kajti nečistote topil in pesticidov imajo lahko
podobno hlapnost in so lahko kemijsko enake ostankom.

26. Oprema in posode, ki jih uporabljamo za analizo ostankov,
morajo biti ustrezno očiščene. Volumetrična steklovina, ki se
lahko ponovno uporablja kot so steklenice, pipete in brizgalke,
mora biti zelo natančno očiščena. Steklovina mora biti ločena za
umeritvene standarde in ekstrakte vzorcev. Izdelki iz gume in
plastike (npr. zamaški, zaščitne rokavice, pralne steklenice),
čistila in maziva, so potencialni viri analitskih interferenc.
Onesnaženje z ditiokarbamati, etilentiosečnino, difenilaminom iz
gumastih izdelkov ali nekaterih mazilnih olj je zlasti
problematično, ker se ne loči od ostankov pesticidov.

27. Tesnila za zamaške morajo biti prevlečeni s teflonom (PTFE).
Ekstrakti naj ne bi prišli v stik s tesnili, zlasti ne po
predrtju. To dosežemo tako, da postavljamo stekleničke pokonci. Če
je potrebna ponovna analiza ekstraktov, moramo zamaške za
stekleničke zamenjati čim prej po predrtju. Stekleničk za enkratno
uporabo ne smemo ponovno uporabiti.

28. Kjer uporabimo interni standard, se moramo izogibati
naključnemu onesnaženju ekstraktov ali pesticidnih raztopin z
internimi standardi in obratno.

Interference

29. Interference iz naravnih sestavin vzorcev, ki jih ekstrahiramo
med analizo ostankov, so pogoste in jih moramo prepoznati. Kjer je
preiskovana spojina prisotna v vzorcu že pred pripravo ali v
vzorcu nastane (npr. anorganski bromid v vseh proizvodih; žveplo v
tleh, ogljikov disulfid, pridobljen iz križnic (Cruciferaceae)),
ostankov z nizkim koncentracijskim nivojem, ki so posledica
uporabe pesticidov, ne moremo razlikovati od naravne prisotnosti
koncentracijskih nivojev. Pri načrtovanju analize in izražanju
rezultatov moramo upoštevati naravno prisotnost teh preiskovanih
spojin. Vsaka interferenca ne povzroči enostavnih, pozitivnih
odzivov detektorja. Učinek povečanja ali zmanjšanja na plinski
kromatografski prenos ali na učinkovitost nastajanja/zbiranja
ionov pri MS lahko povzročijo pesticidi, ki se istočasno izločijo,
ali sestavine matriksa vzorca. Kadar se to zgodi, moramo oceniti
odziv detektorskega sistema na pesticide, in sicer posamezno in z
drugimi pesticidi, v čistem topilu ali v ustreznih ekstraktih
slepih vzorcev. Slepe vzorce reagentov (slepe vzorce postopka)
moramo analizirati pri validaciji metode, in tudi kadarkoli
kasneje, ko je treba razlikovati med interferencami iz matriksa in
interferencami, ki nastanejo med analizo.

Analitska umeritev in kromatografska integracija

Osnovne zahteve za sprejemljivo umeritev

30. V seriji določitev moramo umeritev izvesti z dvema ali več
ponovljenimi meritvami odziva detektorja na vsakem
koncentracijskem nivoju. V vseh primerih morajo biti odzivi
detektorja, ki jih uporabimo za določanje koncentracije ostankov,
znotraj dinamičnega območja detekcijskega sistema.

31. Ko določamo prisotnost ali odsotnost merljivih ostankov v
vzorcih, moramo izražati vsebnost ostankov pod najnižjim
kalibracijskim nivojem (LCL, ki ustreza meji podajanja) kot
"<(LCL) mg/kg", ne glede na to, ali je odziv na preiskovano
spojino viden ali ne. Kjer je potrebno, da poročamo o merljivih
ostankih, ki so pod začetnim LCL, moramo izvesti meritve z novim
in nižjim LCL.

32. Kjer analizirana serija vključuje vzorce z ostanki okrog ali
pod LCL, mora biti odziv detektorja na preiskovano spojino
kvalitativno zaznaven in merljiv na LCL. Kjer odziv ni ustrezen
glede na ciljni LCL, moramo uporabiti višji kalibracijski nivo kot
LCL, ki ustreza kriterijem. Na splošno je minimalno razmerje
signal proti šumu (S/N) 3:1 sprejemljivo za LCL, čeprav se to
lahko nanaša na seštete signale, npr. pri MS podatkih. Čeprav je
razmerje S/N pogosto izraženo kot "elektronski" ali "detektorski"
šum, moramo upoštevati tudi "kemijski šum" motečih spojin, ki se
izločijo istočasno.

33. Umeritev z interpolacijo med dvema nivojema je sprejemljiva,
kjer povprečni odzivni faktor za vsak nivo kaže linearnost odzivov
(npr. če nižji nivo ni manjši kot 90% višjega odzivnega faktorja).
Kjer uporabimo tri ali več koncentracijskih nivojev, bi morala
biti določena primerna umeritvena krivulja. Za umeritveno krivuljo
ni treba, da poteka skozi izhodišče. Kjer so izračuni računalniško
obdelani, moramo prileganje umeritve pregledovati vizualno in se
izogibati zanašanju na korelacijske koeficiente, da zagotovimo
zadovoljivo prileganje na območju, ki je pomembno za določanje
ostankov. Kjer je razlika med nivoji umeritve velika in se zdi
interpolacija vprašljiva, lahko uporabimo posamezne
koncentracijske nivoje za umeritev z eno točko.

34. Izračuni ostankov ali podatkov o izkoristkih z ekstrapolacijo
izven umeritvenega območja lahko povzročijo netočnosti glede na
stopnjo ekstrapolacije. Izračun iz ene umeritvene točke bo
najverjetneje vključeval ekstrapolacijo, s predpostavko o
linearnem odzivu s sečiščem na izhodišču. Ekstrapolacija je
sprejemljiva za izračun rezultatov nad LCL, če je odziv vzorca
znotraj ±10% umeritvenega odziva, kjer je MRL presežen, ali pa
znotraj ±50%, kjer MRL ni presežen. Kjer dodatek standarda za
izkoristek ustreza LCL, lahko izkoristek <100% izračunamo z
ekstrapolacijo, čeprav bo ocena lahko netočna.

35. Umeritev na dveh ali več nivojih, npr. ob dodatni umeritvi na
dvakratni ciljni LCL, nam nudi oporno LCL, če ciljni
koncentracijski nivo ni merljiv; običajno omogoča, da bolj točno
ocenimo širše območje koncentracij ostankov. Umeritev z enim
koncentracijskim nivojem lahko uporabimo za pregled, da ugotovimo,
ali ostanki prekoračujejo umeritveni nivo ali ne, ali pa da
količinsko določimo ostanke, ki so na umeritvenem nivoju ali blizu
njega. S to drugo uporabo lahko dosežemo bolj točne rezultate kot
z mnogostopenjsko umeritvijo, kjer so odzivi detektorja
spremenljivi.

36. Ekstrakte z visoko vsebnostjo ostankov lahko razredčimo in jih
tako spravimo v umeritveno območje, vendar bo morda potrebno tudi
upoštevati "koncentracijo matriksa" v umeritvenih raztopinah,
kajti vpliv matriksa na odziv se lahko zmanjša zaradi razredčitve
sestavin matriksa v ekstraktih vzorcev.

Umeritev v serijah določitev

37. V seriji določitev (npr. kromatografija), morajo kalibracijske
določitve oklepati vzorce. To pomeni, da se mora vsaka serija
začeti in končati z umeritvijo. Morda bodo potrebne vmesne
umeritve, če so odzivi detektorskega sistema preveč spremenljivi.
Pri paralelnih določitvah (npr. ELISA, kjer uporabljamo vzorčno
ploščo s 96 mesti), morajo biti umeritve razporejene tako, da
ugotovimo razlike v odzivih glede na položaj.

38. Na splošno moramo velikost serij meritev prilagoditi tako, da
se odzivi detektorja za ponavljajoče umeritve, ki oklepajo vzorce,
ne razlikujejo za več kot 20%. Kjer se odzivi razlikujejo za več
kot 20%, moramo ponoviti meritve v manjših serijah. Ponovitev
meritev ni potrebna pri vzorcih, ki vsebujejo ostanke 

PRILOGA V (2. del)

Umerjanje v matriksu

40. Sestavine matriksa vzorca ali topil (glej 16. odstavek) lahko
spremenijo potek kromatografije, odziv detektorja ali porazdelitev
pri "head space" analizi. Na splošno morajo biti umeritve
standardov pesticidov pripravljene sveže v ekstraktu matriksa, kar
zagotavlja točno umeritev. Slepi vzorec, uporabljen za umerjanje v
matriksu, je lahko ali pa ni identičen vzorcem, vendar
spremenljiva in nepredvidljiva narava vplivov matriksa zahteva, da
moramo uporabo neidentičnega matriksa ponovno vrednotiti v
določenih časovnih razdobjih. Ustreznost matriksa, ki smo ga
uporabili za pripravo umeritvenih raztopin, lahko preverimo za
vsak posamezni pesticid in vzorec tako, da dodamo znano količino
pesticida ekstraktu vzorca in primerjamo nastalo povečanje v
odzivu preiskovane spojine z odzivom, ki ga je dal umeritveni
standard v ekstraktu domnevno ekvivalentnega matriksa.

41. Kjer material, uporabljen za pripravo umeritvenih standardov v
ekstraktu matriksa vsebuje preiskovano spojino ali povzroča signal
detektorja, ki moti določitev preiskovane spojine, se zahteva
posebna pozornost. Obstaja več primerov, od katerih lahko vsak
povzroči dodatno negotovost končnega rezultata.

41.1 Kjer je preiskovana spojina že naravno prisotna v vseh
vzorcih in so pomembni samo koncentracijski nivoji, ki so mnogo
višji od naravnih; to velja npr. za anorganski bromid v zéleni.
"Ničelni" koncentracijski nivo mora biti vključen v umerjanje,
slepe vzorce pa moramo izbrati zaradi njihovega nizkega nivoja
preiskovane spojine. Koncentracija preiskovane spojine v slepem
vzorcu je določena iz strmine in sečišča ("ničelni"
koncentracijski nivo) umeritvene krivulje in ta vrednost mora biti
prišteta nominalnim umeritvenim koncentracijskim nivojem. Slepe
vrednosti ne smemo odšteti od nivoja, najdenega v vzorcu. "Ničla"
postane ekvivalent koncentracijskemu nivoju v slepem vzorcu in
predstavlja LCL. Slepi vzorec mora biti homogeniziran, kar
zagotavlja, da ostane LCL podoben iz serije v serijo. Rezultati
pod "ničelnim" koncentracijskim nivojem morajo biti izraženi kot v
31. odstavku.

41.2 Kjer je preiskovana spojina naravnega izvora in prisotna v
skoraj vseh vzorcih, pri čemer je njegov koncentracijski nivo
blizu ali nad ciljnim LCL; to velja npr. za ogljikov disulfid iz
zelja. Lahko uporabimo bolj specifično metodo (v tem primeru za
ditiokarbamate) ali pa postavimo ciljni LCL na bistveno višji
koncentracijski nivo in interpretiramo rezultate s previdnostjo.

41.3 Kjer je preiskovana spojina določljiva v vseh vzorcih, a ni
naravno prisotna. To velja npr. za imazalil v določenih citrusih.
Po natančni potrditvi, da so merljivi ostanki resnično pogosto
prisotni, moramo vzorec, ki vsebuje zelo nizek koncentracijski
nivo preiskovane spojine, uporabiti za umeritev, kot smo opisali v
odstavku 41.1.

41.4 Kjer "ozadje" ni posledica preiskovane spojine, temveč
naravne ali sintetične kemikalije, prisotne v nekaterih ali v vseh
vzorcih. Uporabiti moramo bolj učinkovito čiščenje ali bolj
specifičen detekcijski sistem. Kjer to ni mogoče in je maksimalni
nivo, najden v "slepem" vzorcu, pod ciljnim LCL, lahko uporabimo
podoben postopek kot v pododstavku 41.1. V tem primeru moramo
interpretirati rezultate s previdnostjo in ostanki >LCL morajo
biti strogo potrjeni.

42. V analizi GC se običajno zahteva tako umeritvene raztopine v
ekstraktu ustreznega matriksa kot predhodna priprava (priming)
kolone/injektorja. Učinek predhodne priprave je podoben
dolgotrajnem učinku matriksa, vendar je redko trajen in redko
odstrani učinke matriksa. Kjer je zahtevano, predhodno pripravo
izvedemo neposredno pred prvo serijo umeritvenih določitev v
seriji analiz.

Vplivi mešanic pesticidov na umeritev

43. Umeritev in določanje izkoristkov, z uporabo mešanice
standardov pesticidov, je sprejemljivo, vendar moramo sistem
detekcije preverjati na podobnost odziva s pesticidi v ekstraktu
matriksa in sicer posamezno ali v mešanici. V neobičajnih
primerih, kjer se ti odzivi zelo razlikujejo, moramo količinsko
določiti ostanke posameznih pesticidov z uporabo posameznih
umeritvenih standardov. V izjemnih primerih lahko več ostankov
zahteva posebej pripravljen umeritveni standard.

Umeritev za pesticide, ki so mešanica izomer

44. Kjer je umeritveni standard za pesticide mešanica izomer,
lahko na splošno pričakujemo, da bo odziv detektorja podoben, na
molarni osnovi, in to za vsako sestavino. Vendar pa lahko encimski
(npr. holinesteraze) in imunski poskusi privedejo do umeritvenih
napak, če se razmerje sestavin standarda precej razlikuje od
razmerja v merjenem ostanku. Za količinsko določanje takšnih
ostankov moramo uporabiti alternativni detekcijski sistem.

Umeritev z uporabo derivatov ali razgradnjih produktov

45. Kjer je ugotovljeni pesticid kot razgradni produkt ali
derivat, moramo pripraviti umeritvene raztopine iz referenčnega
standarda tega razgradnega produkta ali derivata, če je le ta na
razpolago.

46. Izogibati se moramo določanju pesticidov v obliki nestabilnih
derivatov (npr. nekatere Schiffove baze), če jih ne moremo
pripraviti kot čiste standarde.

Kromatografska integracija

47. Analitik mora skrbno pregledati vse kromatograme, preveriti
njihove osnovne linije, če je potrebno, in jih prilagoditi. Kjer
so prisotni močni kromatografski vrhovi, moramo biti dosledni pri
določanju osnovne linije za vse analize, čeprav takšnih
kromatografskih vrhov ne moremo "pravilno" integrirati. Podobno
dosledni moramo biti pri integraciji kromatografskih vrhov z
repom. Uporabimo lahko višino ali površino vrhov, glede na to, kaj
nam daje bolj točne in ponovljive rezultate (ocenjeno iz podatkov
za izkoristke ali umeritvene podatke).

48. Pri umeritvi s standardi iz mešanih izomer (ali podobnih)
lahko uporabimo seštete površine ali površine kromatografskih
vrhov, ali meritve posameznih sestavin, glede na to, kaj se pokaže
kot bolj točno.

Analitske metode

Sprejemljivost analitskih metod

49. Ustrezna validacija analitske metode omogoča oceno njene
primernosti za namene meritve, čeprav je njeno dobro delovanje v
praksi običajno odvisno od analitika. Informacije o veljavnosti,
ki so podpora izboru metode, se morajo nanašati na primeren obseg
pesticidov in matriksov vzorcev ter lahko vključujejo: (i)
doseženo točnost in natančnost (obnovljivost ali ponovljivost), po
možnosti za primeren obseg koncentracij; (ii) doseženo
občutljivost; (iii) dokaze o specifičnosti; (iv) preizkus
robustnosti.

50. Analitska metoda mora običajno biti sposobna zagotoviti
ponovljiv izkoristek (za pesticide, dodane v koncentracijah, ki so
večje od približno njihove petkratne meje določanja) v obsegu 70-
110% za vse spojine, ki jih iščemo po tej metodi, idealno s
povprečnim izkoristkom za vsako spojino med 80-100%. Kjer
težavnost analize ne omogoča te točnosti in natančnosti in ne
obstaja zadovoljiva alternativna metoda, moramo to upoštevati,
preden uvedemo pravne ukrepe. Preden sprejmemo metodo za
monitoring, moramo oceniti analitikovo delo s to metodo z dvema
ali več določitvami izkoristkov iz ustreznih matriksov vzorcev.
Kjer mora biti ostanek določen kot seštevek, ki izhaja iz dveh ali
več komponent ostanka, moramo delovanje metode oceniti za vse
komponente.

Metode za določanje vsebnosti maščob ali suhe snovi

51. Kjer so rezultati izraženi na osnovi vsebnosti suhe snovi ali
maščob, mora biti metoda, uporabljena za določanje vsebnosti suhe
snovi ali maščobe dosledna. Idealno bi bilo validiranje proti
priznani standardni metodi.

Določanje izkoristka

Vzorci, koncentracije dodatkov standardov, vključitev v analizne
serije

52. Ostanke, ki jim moramo določiti točno koncentracijo, mora
spremljati hkratno določanje izkoristkov. Kjer je mogoče, mora
biti izkoristek vseh preiskovanih spojin določen pri vsaki seriji
analiz. Kjer pa bi to zahtevalo nesorazmerno veliko število
določitev izkoristkov, npr. kjer uporabljamo selektivne detektorje
(npr. ECD, NPD) za zelo veliko število preiskovanih spojin, je
najmanjša sprejemljiva pogostost določitev izkoristkov za različne
razrede pesticidov podana v tabeli 1. Analiza referenčnega
materiala lahko nudi alternativo določanju izkoristkov, kadar
material vsebuje ustrezne preiskovane spojine primernih
koncentracij in če so ostanki pri hranjenju stabilni.

53. Izkoristki pesticidov morajo biti določeni z dodatkom
preiskovane spojine / preiskovanih spojin v matriksu "slepega"
vzorca, podobnega preiskovanemu vzorcu. Koncentracijski nivo
dodatka je lahko 1-10 krat LCL, pri MRL ali na drugem
koncentracijskem nivoju, ustreznim za preiskovane vzorce. Bolje
je, da za izbrane slepe vzorce vemo, da ne vsebujejo merljivih
koncentracij preiskovane spojine / preiskovanih spojin. Kjer slepi
material vsebuje preiskovano spojino v ugotovljivih koncentracijah
(npr. anorganski bromid) ali motečo spojino, mora biti
koncentracija dodatka za izkoristek ł5 kratni koncentraciji,
prisotni v slepem vzorcu. Koncentracija preiskovane spojine (ali
dozdevne preiskovane spojine) v takšnem slepem matriksu mora biti
določena z večkratno analizo. Za signal slepega vzorca mora biti
potrjeno, da je nastal zaradi preiskovane spojine ali drugega
razloga.

54. Kolikor je le mogoče, moramo določiti izkoristek vseh
sestavin, opredeljenih z MRL. Kjer se ostanek določi kot skupno
povprečje, lahko za sestavino, ki običajno prevladuje v ostanku
ali ima najverjetneje najnižji izkoristek (glej tabelo 1).

Sprejemljivost analitskega dela

55. Ne glede na nivoje dodatkov so lahko podatki o rutinskih
izkoristkih bolj spremenljivi, kot bi sklepali iz podatkov o
ponovljivosti, dobljenih pri validaciji metode. Izkoristke moramo
nadzorovati in izvajati korektivne ukrepe, če se pojavi bistven
premik v povprečnem izkoristku ali nesprejemljiv rezultat. V ta
namen moramo paziti pri ocenitvi izkoristka pri LCL. Izkoristke,
ki se razlikujejo od rutinskega povprečja za več kot dva
standardna odmika, bi morali raziskati; izkoristke, ki se
razlikujejo za več kot tri standardne odmike, pa moramo raziskati.
Čeprav to ne pomeni nujno, da so takšni izkoristki nesprejemljivi,
moramo serijo običajno ponovno analizirati. Na splošno rečeno, je
rutinski izkoristek med 60% in 140% sprejemljiv (zelo moramo
paziti pri interpretaciji izkoristka, kjer je koncentracijski nivo
dodatka točno ali približno LOD ali LCL). Kjer se povprečni
rutinski izkoristek približa meji tega območja in je rezultat
izkoristka znatno preko mej območja, moramo rezultate za serijo
vzorcev obravnavati s previdnostjo. Razen v primerih, kjer je
izkoristek nizek, a stalen, in je vzrok za to dobro znan (npr.
zaradi porazdelitve pesticidov v topilih), je lahko sprejemljiv
povprečen izkoristek pod 60%. Toda kadarkoli je mogoče, moramo
uporabiti bolj točno metodo. Če je izkoristek nesprejemljiv za
serijo, moramo ponovno doseči sprejemljive izkoristke in ponovno
analizirati vse vzorce v seriji, ali pa gledati na rezultate kot
le semi-kvantitativne.

56. Kjer je izkoristek za določen pesticid izven 70-110% za
serijo, moramo ponovno analizirati vzorce, pri katerih smo
ugotovili presežene vrednosti ostankov tega pesticida, da bi
dobili točne rezultate, podprte z izkoristki med 70-110%. Če ne
moremo doseči izkoristka v tem okviru, moramo pri sprejemanju
odločitve, kako naprej, priznati, da stopnja ostanka morda ni
dovolj točno znana.

57. V nekaterih primerih določitev izkoristka morda ni mogoča:
npr. pri neposredni analizi tekočih vzorcev in različnih SPME ali
"head space" analizah. Pri neposredni analizi tekočin določa
točnost in natančnost umeritev, s predpostavko, da med vzorčenjem
in analizo ne pride do izgube pesticida (npr. z adsorbcijo). Pri
SPME in "head space" analizi sta točnost in natančnost lahko
odvisni od stopnje, do katere je preiskovana spojina ravnotežno
porazdeljena znotraj faz in med njimi, ter moramo to prikazati,
kjer je mogoče.

Medlaboratorijski primerjalni preskusi in analize referenčnih
materialov

58. Kot je navedeno v 3. odstavku, je bistvena redna udeležba pri
ustreznih medlaboratorijskih primerjalnih preskusih ter reševanje
odkritih problemov z ustreznimi ukrepi. Poleg tega lahko
analiziramo predhodno ovrednotene in homogene interne referenčne
materiale in tako prispevamo k ustvarjanju tekočega dokaznega
materiala za kakovostno analitsko delo, če vemo, da so prisotni
ostanki med hranjenjem stabilni.

Potrjevanje rezultatov

Načela potrjevanja

59. Nemogoče je dokazati popolno odsotnost ostankov, vendar se
privzame, da so rezultati pod LCL - rezultati, katerih ne moremo
izražati v absolutnih številkah - potrjeni, če so izkoristki in
podatki LCL za serijo sprejemljivi. S prevzemom "meje podajanja"
na LCL se izognemo visokim in neupravičenim stroškom dokazovanja
prisotnosti ali odsotnosti ostankov na tako nizkih stopnjah, kjer
ti podatki niso več pomembni. Kjer v serijo analiz nista bila
vključena umeritev ali izkoristek za določen pesticid ali
pesticide, ustrezni podatki za referenčne pesticide nudijo le
posredne dokaze o sprejemljivosti analize. Takšni rezultati ne
morejo veljati kot potrjeni, čeprav so podatki morda ustrezni za
določen namen.

60. Rezultati na ali nad LCL zahtevajo dodatno potrditev. Kjer smo
izvedli serijo analiz brez umeritve za določen pesticid, moramo
obravnavati rezultate kot zelo nezanesljive in potrditev je
bistvena. V tem primeru je najmanjša zahteva ponovna analiza
ekstraktov s primerno umeritvijo za ugotovljeni pesticid/
ugotovljene pesticide. Ker pesticida/ pesticidov, o katerem/
katerih je govora, ne določimo pogosto (glej tabelo 1) in je torej
neobičajen, je bolje, če ponovimo analizo vzorca z istočasno
določitvijo izkoristka.

61. Kjer bodo izvedeni upravni ukrepi, ali kjer bodo sprejete
druge pomembne odločitve, na osnovi rezultatov nad LCL, sta
bistvenega pomena sprejemljiva hkratna umeritev in določitev
izkoristkov, podprta z nadaljnjo potrditvijo. Narava in širina
zahtevane nadaljnje potrditve je odvisna od relativnega pomena
določenega rezultata in pogostosti ugotavljanja podobnih ostankov.
Postopki nadzora kakovosti za potrditev analize morajo biti
strogi.

Pristopi k potrditvi

62. Potrditev ugotovljene preiskovane spojine mora biti
kvantitativna in kvalitativna.

63. Preskusi na osnovi imunokemije, kolorimetrije, tankoplastne
kromatografije ali detektorji na zajetje elektronov se nagibajo k
temu, da zaradi pomanjkljive specifičnosti zahtevajo čim boljšo
potrditev. Kjer uporabimo "selektivne" detektorje z GC ali LC,
druga kromatografska kolona bistveno različne polarnosti (ali drug
"specifičen detekcijski sistem) nudi le omejene dokaze za
potrditev. To je lahko sprejemljivo za pogoste nizke koncentracije
ostankov, kjer je delež ostankov potrjen tudi z bolj definiranimi
tehnikami, vendar je vedno bolje že v osnovi uporabiti bolj točno
tehniko.

64. Kjer je ostanek nad MRL, ali kjer ne sme biti prisoten v
vzorcu, moramo potrditi rezultat z najbolj zanesljivo
razpoložljivo metodo in z analizo enega ali več dodatnih
analitskih delov vzorcev. Ostanke v teh dodatnih delih lahko
količinsko določimo s pregledovalno (screening) ali potrditveno
tehniko. Število dodatnih delov vzorca za analizo mora biti
določeno glede na različnost dobljenih rezultatov.

Potrditev z masno spektrometrijo

65. MS omogoča skoraj nedvomno potrditev ostankov večine
pesticidov, vendar morajo biti podatki za potrditev v skladu z
določenimi najmanjšimi zahtevami. Običajno moramo uporabiti
umeritvene standarde v ekstraktu ustreznega matriksa za potrditev
količine, vendar moramo referenčni masni spekter dobiti iz
referenčnega standarda ali njegove raztopine v čistem topilu. Da
se izognemo popačenju ionskih razmerij, ne smemo s količino
standarda, ki ga uporabimo za referenčni spekter, preobremeniti
detektorja. Potrditev visokih koncentracijskih nivojev ostankov je
jasna, toda rezultate blizu meje določitve MS moramo obravnavati
od primera do primera.

66. Kromatogrami izbranih ionov morajo imeti vrhove (najmanj tri
snemanja, najmanjši seštevek S/N 3:1) s podobnim retenzijskim
časom, obliko vrha in razmerjem odzivov kot vrhovi, ki jih dobimo
iz umeritvenega standarda, analiziranega v isti seriji. Kjer
kromatogrami navidezno nepovezanih ionov vključujejo vrhove s
podobnim retenzijskim časom in podobno obliko, ali kjer ta
informacija ni na razpolago (npr. iz "omejenega skeniranja" ali
snemanja izbranih ionov), morda potrebujemo dodatno potrditev.
Kjer ionski kromatogram kaže znatne kromatografske motnje, se na
ta ion ne moremo zanesti pri količinskem določanju ali
identifikaciji ostankov.

67. Če je primerno, moramo spektrom odšteti ozadje, pri čemer
moramo ozadje pazljivo izbrati, da se izognemo popačenju podatkov.
Kjer ioni, ki niso povezani s preiskovano spojino v povprečnem
spektru celotnega snemanja (full scan) vrha, (t.j. med m/z 50 in
50 masnih enot večjimi od "molekularnega iona"), ne presegajo
četrtine intenzitete osnovnega vrha v spektrih, dobljenih z
elektronsko ionizacijo, ali ene desetine pri vseh drugih
ionizacijskih metodah, lahko sprejmemo spekter kot zadovoljiv
dokaz identitete. Kjer so te meje prekoračene in nepovezani ioni
prihajajo iz kromatografsko neločenih spojin, lahko odštejemo
drugo izbrano ozadje in/ali iščemo dodatne dokaze. Razmerja
intenzitet glavnih ionov morajo biti med 80-120% tistih, ki smo
jih dobili pri standardu. Kjer ionski kromatogram kaže na večje
kromatografske motnje, tega iona ne smemo uporabiti za določanje
razmerja intenzitet in potrebna je dodatna potrditev. Za
količinsko določanje ostanka moramo uporabiti najintenzivnejši
ion, ki ne kaže kromatografskih motenj. Zlasti s pomočjo
elektronske ionizacije lahko uporabimo odsotnost motečih ionov za
potrditev identifikacije, kjer je spekter preiskovane spojine zelo
enostaven.

68. Elektronska ionizacija ali nadaljnja fragmentacija izbranih
ionov (MS/MS), povezana s snemanjem spektrov celotnega snemanja
(full-scan), navadno nudi najbolj odločilne dokaze identitete in
količine. Masni spektri, dobljeni z nizko energijskimi procesi
(npr. kemijska ionizacija, ionizacija pri atmosferskem tlaku) so
lahko preveč enostavni, da bi potrdili identiteto brez nadaljnjih
dokazov. Če razmerje izotopov iona/ionov ali kromatografski profil
izomer preiskovane spojine niso zelo značilni, bo verjetno treba
poskrbeti za dodatne podporne dokaze. Ti so lahko: (i) drugačen
ločitveni kromatografski sistem; (ii) drugačna tehnika ionizacije;
(iii) MS/MS; (iv) uporaba srednje/visoko ločljive MS; ali (v)
drugačna fragmentacija, tako da spremenimo električno napetost v
LC-MS. Z uporabo srednje/visoko ločljive MS ali MS/MS morajo biti
izbrani ioni, ki so, kjer je mogoče, značilni za pesticid, kot pa
da pripadajo številnim organskim spojinam.

69. Spektri celotnega snemanja (full-scan) omogočajo najbolj
prepričljivo identifikacijo, vendar lahko občutljivost izboljšamo
s snemanjem omejenega območja mas ali izbranih ionov. S temi
tehnikami je najmanjša zahteva za podatke za dva iona z m/z >200
ali tri ione z m/z >100. Kjer spekter preiskovane spojine ne
omogoča izpolnitve teh zahtev, moramo priskrbeti dodatne potrditve
(glej 68. odstavek).

Potrditev v neodvisnem laboratoriju

70. Kjer pomembnih ostankov ne moremo potrditi lokalno, lahko
potrditev izvedemo v drugem laboratoriju, če je to izvedljivo.

Poročanje o rezultatih

Podajanje rezultatov

71. Običajno moramo rezultate izražati, kot jih definira MRL in v
mg/kg. Pri vzorcih z ostanki, ki so manjši od LCL, izražamo
rezultate kot <(LCL) v mg/kg.

Izračun rezultatov

72. Podatkov o ostankih običajno ne smemo popravljati za
izkoristek. Rutinski izkoristek omogoča spremljanje analitskega
dela in daje splošne smernice o točnosti rezultatov. Ne določa pa
nujno tudi točnosti in nezanesljivosti (glej 77. odstavek)
dosežene za posamezni vzorec. Rezultati ne smejo biti popravljeni
za vrednosti slepega vzorca, kadar so te nujne zaradi preiskovane
spojine (glej 41. odstavek).

73. Kjer so potrjeni podatki dobljeni iz enega analitskega dela
vzorca (t.j. ostanek ne presega normativa ali ni nenavaden), mora
podani rezultat izhajati iz tiste tehnike določanja, ki jo
smatramo za najbolj točno. Običajno je to tehnika, ki omogoča
najboljšo specifičnost. Kjer dobimo rezultate po dveh enako točnih
tehnikah, lahko podamo povprečno vrednost.

74. Kjer sta bila analizirana dva ali več analitskih delov vzorca,
podamo aritmetično sredino najbolj točnih rezultatov iz vsakega
dela. Kjer smo opravili dobro drobljenje in/ali mešanje vzorcev,
RSD rezultatov analitskih delov ne sme presegati 30%, če je
merjeni ostanek precej večji od LOD. Blizu LOD so lahko nihanja
rezultatov mnogo večja in to moramo upoštevati pri odločitvi o
nadaljnjem postopku.

75. Kjer opredelitev MRL vključuje dve ali več spojin, med ostanki
pogosto prevladuje ena komponenta. Kjer sestavine določamo ločeno
(ne pa kot seštevek), mora biti celotna meja podajanja za pesticid
LCL za komponento, ki daje najmanjši odziv na molarni osnovi. Če
je npr. LCL za izomere endosulfana 0,05 mg/kg in za sulfatne
metabolite 0,1 mg/kg, mora biti celotna meja podajanja za
endosulfan 0,1 mg/kg. Pri referenčnem standardu z dvema ali več
komponentami, ki dajo podobne molarne odzive, razlikujejo pa se v
koncentracijah - npr. mešani izomeri klorfenvinfosa, se meja
podajanja lahko nanaša na sestavino, ki povzroča največji
absolutni odziv. Če uporabimo ta postopek, lahko odsotnost
značilnega profila komponent oteži identifikacijo ostankov na ali
okoli meje podajanja, kar zahteva uporabo bolj stroge tehnike
potrditve.

Zaokrožanje podatkov

76. Ko izražamo rezultate <0,1 mg/kg, moramo podatke zaokrožiti na
eno pomembno številko; rezultate ł0,1 vendar <10 mg/kg zaokrožimo
na dve pomembni številki; rezultate ł10 mg/kg lahko zaokrožimo na
tri pomembne številke ali na celo število. Te zahteve ne odražajo
nujno nezanesljivosti, povezane s podatki.

Določanje negotovosti rezultatov

77. Merilna negotovost je uporabno merilo zaupanja v rezultate.
Podatki o negotovosti ne morejo nadomestiti potrebe po potrditvi
in so potrebni predvsem za potrditev zelo pomembnih rezultatov.
Predpisi ISO za ovrednotenje in izražanje merilne negotovosti pri
merjenju4 zahtevajo ugotavljanje možnih virov negotovosti, ki
vplivajo na rezultat. Ta formalni postopek lahko uporabimo, če se
to zahteva, lahko pa uporabimo tudi preprostejšo metodo, kot je
uporaba standardnega odmika ponovljivosti ali interne
obnovljivosti. Te vrednosti lahko dobimo iz podatkov za izkoristke
ali iz analize referenčnih materialov. Vendar se morajo podatki o
negotovosti nanašati na specifičen pesticid in morajo izhajati iz
ustreznega matriksa pri približno enaki koncentraciji kot je
vzorec. Lahko je torej potrebno dobiti podatke o negotovosti iz
izkoristkov v ustreznem območju koncentracij. Idealno bi bilo, če
bi dobili podatke o negotovosti iz paralelnih analiz 5 do 10 delov
vzorca in bi zajeli negotovosti tako podvzorčenja kot analize.
Negotovost lahko podamo kot 95 odstotni interval zaupanja
rezultata.

Odločitve o skladnosti

78. Pri odločitvi, ali rezultati analize ostanka pomenijo
preseganje MRL, moramo upoštevati ugotovljeno koncentracijo in
veljavnost merjenja, ki se kaže v ustreznih podatkih nadzora
kakovosti. Odločitve o ukrepih, ki bodo sledili, moramo sprejeti
od primera do primera.

79. Kjer ostanki iz vzorcev, vzetih iz cele količine, ne presegajo
MRL, celotna količina ustreza MRL.

80. Kjer rezultati za laboratorijske vzorce, vzete iz cele
količine, presegajo MRL, moramo pri odločitvi, da celotna količina
ne ustreza, upoštevati naslednje: (i) območje rezultatov,
dobljenih iz paralelnih laboratorijskih vzorcev in/ali paralelnih
analitskih delov vzorca, ko je to uporabno; in (ii) točnost in
merilno negotovost analize. Običajno zahteva odločitev o
neustreznosti sprejemljivo umeritev, istočasno določitev
izkoristkov in podatke o potrditvi. Kjer je prisotnost pesticida
nesprejemljiva ne glede na stopnjo, celotna količina ne ustreza,
če je ostanek na ali nad LCL in je potrjena njegova identiteta.

81. Kjer prisotnost nizke koncentracije pesticida pomeni sproženje
upravnih ukrepov, moramo upoštevati možnosti medsebojnega
onesnaženja, do katerega bi lahko prišlo pred vzorčenjem, med njim
ali po njem.

Hranjenje informacij

82. Zapise podatkov o vzorcih, laboratorijske dnevnike,
kromatograme, tabele z rezultati, diskete ali trakove, ki
vsebujejo kromatografske ali spektralne podatke ipd., moramo
shraniti za možne kasnejše preglede. Po predaji poročila moramo
hraniti podatke pet let za vzorce s preseženim MRL ali
prisotnostjo pesticida, ki ni dovoljen, in dve leti za ostale
vzorce.

Slovarček

Serija

Za ekstrakcijo, čiščenje in podobne procese je to serija vzorcev,
s katerimi dela analitik (ali ekipa analitikov) vzporedno,
običajno v enem dnevu, in mora vključevati vsaj eno določitev
izkoristkov. Za postopek določanja je to serija določitev brez
večjega premora in mora vključevati vse pomembne umeritvene
določitve. Serije določitev lahko imenujemo tudi "analitske
meritve", "zaporedja meritev", "kromatografske meritve" ipd., pri
formatih kot so vzorčna plošča s 96 mesti pa bo ena plošča
predstavljala serijo. Serija določitev lahko vključuje več kot eno
serijo ekstrakcij.

Slepi vzorec

(i) Vzorec, za katerega vemo, da ne vsebuje zaznavne koncentracije
iskane preiskovane spojine. Ekstrakt (ali ekvivalent) takšnega
vzorca je znan tudi kot slepi vzorec matriksa. (ii) Celotna
opravljena analiza, pri kateri uporabimo samo topila in reagente,
v odsotnosti vsakršnega vzorca (v določenih primerih je morda
potrebno nadomestiti vzorce z vodo, da bi bila analiza bolj
realistična); znano tudi kot slepi vzorec reagentov ali slepi
vzorec postopka.

Oklepanje vzorcev

Oblikovanje serije meritev, kjer detekcijski sistem umerimo tik
pred in po analizi vzorcev; npr. umeritveni standard 1, umeritveni
standard 2, vzorec 1... vzorec n, umeritveni standard 1,
umeritveni standard 2.

Umeritev

Določanje odziva detekcijskega sistema na preiskovano spojino v
območju koncentracij, ki jih izražamo, in v času preiskovanja
vzorcev. Raztopine, ki jih uporabimo v ta namen, lahko imenujemo
umeritvene raztopine, umeritveni standardi ali umeritveni
ekstrakti. Umeritev odzivov detektorja je popolnoma drugačna od
umeritve opreme za tehtanje in volumetrijo, umeritve masnih
spektrometrov ipd.

CHEK

Shema za medlaboratorijske primerjalne preskuse, ki ga organizira
Inšpektorat za zaščito zdravja, Groningen, Nizozemska.

ECD

Electron-capture detector - detektor na zajetje elektronov.

ELISA

Enzyme-linked immuno-sorbent assay - imunske metode analize z
encimi.

EU

Evropska Unija.

FAPAS

Food Analysis Performance Assessment Scheme - načrt za ocenitev
izvajanja analize prehrane; t.j. načrt za medlaboratorijske
primerjalne preskuse, ki ga organizira Ministrstvo za kmetijstvo,
ribištvo in prehrano, Norwich, Velika Britanija.

FPD

Flame-photometric detector - plamensko fotometrični detektor (ki
je lahko specifičen za odkrivanje žvepla in fosforja).

GC

Gas chromatography - plinska kromatografija (plinsko-tekočinska
kromatografija).

Interna reproducibilnost

Ponovljivost izkoristka preiskovane snovi, ki jo dosežemo v
laboratoriju z uporabo iste metode ob večkratnih priložnostih.

LC

Liquid chromatography - tekočinska kromatografija (pretežno
tekočinska z visoko ločljivostjo).

LCL

Lowest calibrated level - najnižji umeritveni koncentracijski
nivo. Najnižja koncentracija preiskovane spojine, s katero je
sistem umerjen, ko določamo prisotnost ali odsotnost merljivih
ostankov. Običajno je to meja podajanja.

Koncentracijski nivo

Se običajno nanaša na koncentracijo (npr. mg/kg, mg/ml), lahko pa
tudi na količino (npr. ng, pg).

LOD

Limit of determination - meja določanja (ali meja kvantitacije).

Matriks slepega vzorca

Glej "Slepi vzorec".

Umerjanje s standardi v ekstraktu ustreznega matriksa

Glej tudi "umeritev". Uporaba umeritvenih raztopin ali "head
space" porazdelitev ali vlaken SPME ipd., v katerih so vse
sestavine (razen preiskovane spojine) podobne ali povzročijo enak
učinek na analitski odziv kot ustrezni ekstrakti vzorcev, ki jih
moramo analizirati. Slepi vzorec matriksa (glej "Slepi vzorec"
zgoraj) mora biti pripravljen z uporabo podobnih topil, reagentov,
načina čiščenja ipd., kot jih uporabljamo za analizo ustreznih
vzorcev. Pesticid je npr. dodan slepemu ekstraktu (ali slepemu
vzorcu za "head space" analizo) podobnega matriksa kot je tisti,
ki ga analiziramo. Cilji so: (i) kompenzirati povečan ali zmanjšan
odziv detektorja ki je posledica vzporedno ekstrahiranih sestavin
matriksa; (ii) dobiti kromatogram za integracijo, ki ima z vzorcem
primerljive interference. Uporabljan matriks se lahko razlikuje od
matriksa samega vzorca, če z njim dosežemo te cilje.

MRL

Maximum residue limit - največja dovoljena količina ostankov.

MS

Mass spectrometry - masna spektrometrija.

MS/MS

Tandemska masna spektrometrija, ki tu vključuje MSn. V postopku
MS, je določen ion izoliran iz postopka primarne ionizacije in
fragmentiran s trkovno aktivacijo ali drugače in se ti produkti
ionov ločijo (MS/MS ali MS2. Postopek lahko izvedemo večkrat na
nizu produktov ionov (MSn), čeprav to običajno ni smiselno za
ostanke pri nizkih koncentracijah.

NPD

Nitrogen-phosphorus detector - dušik-fosfor detektor.

Predpriprava GC injektorja/kolone

Preliminarna deaktivacija kolone GC in/ali injektorja, z
injiciranjem primerne raztopine ali ekstrakta tik pred začetkom
serije določitev. Običajno pride do povečanega odziva za
preiskovano spojino zaradi povečanega prenosa. Ekstrakti, ki jih
uporabljamo za ta postopek, niso nujno iz istega matriksa kot
analizirani vzorci. Da se izognemo prenašanju preiskovane snovi,
je bolje, da pripravljeni ekstrakti vsebujejo malo ali nezaznavno
količino pesticida.

Slepi vzorec postopka

Glej "Slepi vzorec".

Slepi vzorec reagentov

Glej "Slepi vzorec".

Referenčni pesticid

Pesticid, ki mora biti vključen pri določevanju izkoristkov in pri
umeritvi v vsaki seriji analiz (odstavki 33-35).

Referenčni material

Vzorec, ki je bil opredeljen na vsebnost pesticida. Certificirani
referenčni materiali so običajno preiskani v številnih
laboratorijih na koncentracijo in homogenost porazdelitve
pesticida. Interni referenčni materiali so preiskani v posameznem
laboratoriju in, v kolikor je mogoče, mora biti razvidno, da so
homogeni in stabilni.

Referenčni spekter

Absorbcijski (npr. UV, IR), fluorescenčni, masni spektri ipd., ki
so dobljeni za preiskovano spojino in zanjo značilni. Referenčni
masni spekter naj bo po možnosti dobljen iz referenčnega standarda
(ali iz njegove raztopine) z instrumentom, ki ga uporabljamo za
analizo vzorcev in z uporabo podobnih pogojev ionizacije.

Referenčni standard

Relativno čist vzorec preiskovane spojine (ali internega
standarda), znane čistosti. Običajno je čistost >90%, razen pri
tehničnih koncentratih določenih pesticidov.

Meja podajanja

Najnižji koncentracijski nivo, pri katerem izražamo ostanke v
absolutnih številkah. Lahko predstavlja praktično mejo določanja
ali pa je lahko nad to mejo, da omejimo stroške analize. Biti mora
enak najnižjemu umeritvenemu koncentracijskemu nivoju (lowest
calibrated level - LCL), pod katerim ni eksperimentalnih dokazov,
da bi ostanke pesticidov zadovoljivo določili in umerili.

RSD

Relative standard deviation - relativni standardni odmik
(koeficient variacije).

SFE

Supercritical fluid extraction - ekstrakcija s superkritično
tekočino.

Razredčenje v trdni fazi

Razredčenje pesticida s porazdelitvijo v fino zdrobljeni trdni
snovi, kot je škrobni prah. Običajno se uporablja le za netopne
preiskovane spojine, kot so kompleksni ditiokarbamati.

S/N

Signal-to-noise ratio - razmerje signal proti šumu.


SPME

Solid phase micro-extraction - mikroekstrakcija na trdni fazi.

____________________________

1 V uredbi o monitoringu pesticidov v živilih in kmetijskih
proizvodih so prevzete določbe vzorčevanja iz direktive
79/700/EEC.

2 Npr. 4.4' diklorobenzofenon iz dikofola, tetrahidroftalimid iz
kaptana in kaptafola, ftalimid iz folpeta, 2-klorobenconitril iz
klofentezina.

3 Tudi t-test povprečij ne sme pokazati pomembne razlike na
stopnji 5%.

4 Anonimno (1993), "Guide to the expression of uncertainty in
measurement" (ISBN 92-67-10188-9).

ISO, Ženeva, Švica.