Vaše trenutno stanje
- Zahtevano
- Analitika
- Oglaševanje
Prikaži podrobnosti
PRILOGA
METODA KEMIJSKE ANALIZE
I. SPLOŠNO
1. Priprava vzorca
1.1 Splošno
Masa v laboratorij dostavljenega vzorca za analizo mora
biti 50 g, razen če ni zahtevana večja količina.
1.2 Priprava vzorca v laboratoriju
Pred pričetkom analize se mora vzorec homogenizirati.
1.3 Posode
Tako pripravljen vzorec se mora hraniti v za zrak in vlago
nepropustnih posodah (v hermetično zaprtih posodah).
2. Reagenti
2.1 Voda
2.1.1 Za raztapljanje, razredčevanje ali izpiranje se mora
uporabljati destilirana ali najmanj enako čista
demineralizirana voda.
2.1.2 Če reagent ni posebej določen, pomeni "raztopina" ali
"razredčevanje" vodno raztopino oziroma razredčenje z
vodo.
2.2 Kemikalije
Vse uporabljene kemikalije morajo biti, razen če ni
določeno drugače, priznane analitske čistosti.
3. Oprema
3.1 Seznam opreme
Ta seznam vsebuje samo tisto opremo, ki je namenjena
posebni uporabi in za katero obstaja specifikacija.
3.2 Analitska tehtnica
"Analitska tehtnica" pomeni tehtnico z občutljivostjo 0,1
mg ali več.
4. Podajanje rezultatov
4.1 Rezultati
Rezultati, ki se podajajo v uradnem poročilu o analizi,
morajo biti srednje vrednosti najmanj dveh določitev,
katerih ponovljivost je zadovoljiva.
4.2 Izračun odstotkov
Če ni določeno drugače, se rezultati izrazijo kot odstotki
(m/m) skupnih maščobnih kislin v vzorcu, kot je bil
dostavljen v laboratorij.
4.3 Število značilnih (signifikantnih) številk
Število značilnih (signifikantnih) številk je odvisno od
natančnosti metode.
II. PRIPRAVA METIL ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN
1. Splošno
Namen te metode je pretvorba olj in maščob živalskega
ali rastlinskega izvora, ali maščobnih kislin
kakršnegakoli izvora, v metil estre maščobnih kislin.
Tako dobljeni metil estri se lahko uporabijo pri vsaki
metodi, ki zahteva takšno obliko, vključno s plinsko
kromatografijo, tankoplastno kromatografijo in
infra-rdečo spektrofotometrijo.
2. Področje uporabe
Opisana metoda se uporablja za olja in maščobe
živalskega ali rastlinskega izvora. Metoda, opisana pod
3, se uporablja za pripravo metil estrov maščobnih
kislin, ki vsebujejo šest ali več ogljikovih atomov.
Pri uporabi splošne metode, opisane pod 3.1, obstaja
možnost napak pri rezultatih v prisotnosti:
- spojin s sekundarnimi kisikovimi skupinami (hidroksi,
hidroperoksi, keto ali epoksi skupine);
- spojin s ciklopropanskimi ali ciklopropenskimi
skupinami;
- konjugiranih poli nenasičenih spojin in acetilenskih
spojin;
- voskov.
V takih primerih se priporoča uporaba ene izmed
alternativnih metod, opisanih pod 3.2.
Fosfolipidi se lahko analizirajo po saponifikaciji in
esterifikaciji maščobnih kislin.
Snovi, ki se ne saponificirajo, se ne odstranijo in, če
so prisotne v kakršnikoli znatnejši količini, lahko
motijo pri nadaljnji analizi (Opomba 1).
3. Priprava metil estrov maščobnih kislin s šest ali več
ogljikovimi atomi
Splošna metoda priprave metil estrov z uporabo bor
trifluorida, kot je opisana pod 3.1 naj bi imela
prednost pred ostalimi. Če njena uporaba ni možna, se
lahko uporabi alternativna metoda, opisana pod 3.2.
3.1 Splošna metoda z uporabo bor trifluorida
3.1.1 Princip
Saponifikacija gliceridov, sprostitev in esterifikacija
maščobnih kislin v prisotnosti bor trifluorida.
3.1.2 Pribor
3.1.2.1 Bučke, 50 in 100 ml, z brušenimi vratovi;
3.1.2.2 Povratni hladilnik, dolžine 20 do 30 cm, z brušenim
nastavkom za bučke;
3.1.2.3 Vrelni kamenčki;
3.1.2.4 Cevke za prepihovanje z dušikom;
3.1.2.5 Graduirane pipete, 10 ml ali več, s pileusovo žogico,
ali avtomatske pipete;
3.1.2.6 Epruvete z brušenim grlom in brušenim zamaškom;
3.1.2.7 Lij ločnik, 250 ml.
3.1.3 Reagenti
3.1.3.1 Natrijev hidroksid, metanolna raztopina, približno 0,5
N: 2 g natrijevega hidroksida raztopimo v metanolu,
ki vsebuje manj kot 0,5% (m/m) vode. Če se raztopina
hrani dalj časa, se pojavi v njej nekoliko natrijevaga
karbonata v obliki bele oborine, kar ne vpliva na
pripravo metil estrov.
3.1.3.2 Bor trifluorid, metanolna raztopina 12 do 15% (m/m).
(Komercialno so na voljo 14% in 50% raztopine) Opomba
2);
Opozorilo: Bor trifluorid je strupen, zato se ne priporoča, da ga
uporabnik pripravlja sam iz bor trifluorida in
metanola (Opomba 3).
3.1.3.3 Heptan, za kromatografijo (Opomba 2, Opomba 4);
3.1.3.4 Petrol eter, redestiliran (vrelišče 40-60 stopinj C), z
bromnim številom nižjim od 1, brez heksana, ali heksan
(Opomba 2);
3.1.3.5 Natrijev sulfat, brezvodni;
3.1.3.6 Natrijev klorid, nasičena raztopina;
3.1.3.7 Metil rdeče, 0,1% (m/v) raztopina v 60% (v/v) etanolu;
3.1.3.8 Dušik, ki vsebuje manj kot 5 mg kisika/kg plina.
3.1.4 Postopek.
Glede na toksičnost bor trifluorida, se morajo vsi nadaljnji
postopki analize izvajati v digestoriju. Stekleni pribor se mora
oprati takoj po uporabi.
Če olja ali maščobne kisline vsebujejo več kot dve dvojni vezi,
se priporoča odstranitev zraka iz metanola in bučke z nekaj
minutnim prepihovanjem z dušikom. Vzorec pripravimo v skladu z
I,1.2. Točno tehtanje ni potrebno. Velikost vzorca za analizo
mora biti znana le glede na pravilno izbiro bučke in količine
reagentov v skladu s podatki iz tabele:
--------------------------------------------------------------------------------
Količina vzorca Bučka 0,5 N NaOH Raztopina BF3 v metanolu Heptan
(3.1.2.1) (3.1.3.1) (3.1.3.2) (3.1.3.3)
--------------------------------------------------------------------------------
(mg) (ml) (ml) (ml) (ml)
--------------------------------------------------------------------------------
100-250 50 4 5 1 do 3
250-500 50 6 7 2 do 5
500-750 100 8 9 4 do 8
750-1000 100 10 12 7 do 10
--------------------------------------------------------------------------------
Primerna količina vzorca za plinsko kromatografsko analizo metil
estra je 350 mg. Če je ta količina manjša, je reprezentativnost
vzorca vprašljiva (Opomba 5).
3.1.4.1 Maščobe in olja
V bučko prenesemo primerno količino vzorca za analizo. Dodamo
pravilno izbrano količino raztopine natrijevega hidroksida in
vrelne kamenčke. Bučko spojimo s povratnim hladilnikom. Segrejemo
do vrenja in pustimo vreti, dokler ne izginejo kapljice olja ali
maščobe (ta del postopka traja 5 do 10 minut, v izjemnih primerih
je čas lahko tudi daljši).
Z graduirano pipeto, opremljeno s pileusovo žogico, ali z
avtomatsko pipeto, dodamo v vrelo raztopino z vrha povratnega
hladilnika pravilno izbrano količino metanolne raztopine bor
trifluorida. Nadaljujemo z vrenjem 2 minuti. V vrelo raztopino
dodamo z vrha povratnega hladilnika 2 do 5 ml heptana (Opomba 4);
(količina heptana ne vpliva na reakcijo) in nadaljujemo z vrenjem
1 minuto. Odmaknemo toplotni izvor in odstranimo povratni
hladilnik. Dodamo nekoliko ml nasičene raztopine natrijevega
klorida (3.1.3.6) in s počasnim krožnim mešanjem premešamo
vsebino v bučki.
V bučko dodajamo nasičeno raztopino natrijevega klorida, dokler
raztopina ne seže do grla bučke. Približno 1 ml zgornjega sloja
(raztopina heptana) prenesemo v epruveto z brušenim grlom. Dodamo
toliko brezvodnega natrijevega sulfata, da odstranimo sledove
vode. Če je bila količina vzorca za analizo 350 mg, dobljena
raztopina vsebuje približno 5 do 10% metil estrov in se lahko
neposredno vbrizga v kolono plinskega kromatografa. Če to ni
tako, razredčimo raztopino heptana tako, da dobimo 5 do 10%
koncentracijo metil estrov (Opomba 6).
Celotno količino estrov v suhi obliki dobimo tako, da prenesemo
raztopino soli skupaj s heptansko fazo v 250 ml lij ločnik in
raztopini ločimo. Raztopino soli ekstrahiramo s 50 ml petrol etra
(vrelišče 40 do 60 stopinj C) ali heksana.
Ekstrakcijo ponovimo. Heptansko fazo in ekstrakte združimo ter
spiramo s po 20 ml porcijami vode do negativne kisle reakcije
(indikator metil rdeče). Osušimo z natrijevim sulfatom in uparimo
topilo na vodni kopeli v toku dušika (Opombi 6 in 7). Če je bila
količina vzorca za analizo manjša od 500 mg, se priporoča
proporcionalno zmanjšanje volumnov topila in vode.
3.2 Alternativna metoda brez uporabe bor trifluorida
3.2.1 Nevtralna olja in maščobe (kislinsko število < 2)
3.2.1.1 Princip
Metanoliza gliceridov v alkalni sredini
3.2.1.2 Oprema
3.2.1.2.1 Mešalec z veliko hitrostjo in primernim grelcem (npr.
magnetni mešalec z grelcem);
3.2.1.2.2 Bučka s konusnim ali okroglim dnom, 100 ml, z brušenim
grlom;
3.2.1.2.3 Cev za prepihovanje z dušikom;
3.2.1.2.4 Povratni hladilnik, ki se ujema z bučko s konusnim ali
okroglim dnom;
3.2.1.2.5 Vrelni kamenčki;
3.2.1.2.6 Lij ločnik, 125 ml;
3.2.1.2.7 Konusna bučka z ozkim vratom (erlenmajerica).
3.2.1.3 Reagenti
3.2.1.3.1 Metanol z manj kot 0,5% (m/m) vode;
3.2.1.3.2 Kalijev hidroksid, metanolna raztopina, približno 1 N:
5,6 g kalijevega hidroksida raztopimo v 100 ml
matanola, ki vsebuje manj kot 0,5% vode;
3.2.1.3.3 Heptan, za kromatografijo (Opombi 2 in 4);
3.2.1.3.4 Natrijev sulfat, brezvodni;
3.2.1.3.5 Dušik, ki vsebuje manj kot 5 mg kisika/kg plina.
3.2.1.4 Postopek.
Če olje vsebuje kisline, ki imajo več kot dve dvojni vezi, se
priporoča odstranitev zraka iz metanola in bučke s prepihovanjem
z dušikom.
Priprava vzorca.
V 100 ml konusno bučko ali bučko z okroglim dnom prenesemo
približno 4 g (Opomba 4) pripravljenega olja ali maščobe.
Dodamo približno 40 ml metanola (3.2.1.3.1), 0,5 ml metanolne
raztopine kalijevega hidroksida (3.2.1.3.2) in vrelne kamenčke.
Spojimo s povratnim hladilnikom, mešamo in segrejemo do vrenja.
Raztopina mora postati bistra. Reakcija je običajno končana v 5
do 10 minutah. Pri oljih tipa ricinovo olje bistrost ni kriterij
dokončanja reakcije (Opomba 8).
Ohladimo pod tekočo vodo in prenesemo v 125 ml lij ločnik.
Konusno bučko ali bučko z okroglim dnom speremo z 20 ml heptana
(Opomba 4), ki ga prelijemo v lij ločnik.
Dodamo približno 40 ml vode, pretresemo in pustimo, da se
raztopini ločita. Estri se nahajajo v zgornjem heptanskem sloju.
Vodni sloj ponovno ekstrahiramo z 20 ml heptana. Oba ekstrakta
združimo in dvakrat speremo s po 20 ml vode. Ločimo, raztopino
estrov osušimo z brezvodnim natrijevim sulfatom in filtriramo
skozi bombažno vato v 50 ml erlenmajerico; če je potrebno,
odparimo topilo do 20 ml pri temperaturi vrenja na vodni kopeli v
toku dušika (Opombi 6 in 7).
3.2.2 Kisla olja in maščobe (kislinsko število > 2) ter
maščobne kisline.
3.2.2.1 Princip.
Nevtralizacija prostih maščobnih kislin, alkalna metanoliza
gliceridov, ki ji v primeru kislih olj in maščob sledi
esterifikacija maščobnih kislin v kislem mediju.
3.2.2.2 Oprema
3.2.2.2.1 Mešalo z veliko hitrostjo in primernim gretjem (npr.
magnetno mešalo z grelcem);
3.2.2.2.2 Konusne bučke ali bučke z okroglim dnom, 250 ml, z
brušenim grlom;
3.2.2.2.3 Cevke za prepihovanje z dušikom;
3.2.2.2.4 Povratni hladilnik z brušenim nastavkom, ki se ujema s
konusno bučko ali bučko z okroglim dnom;
3.2.2.2.5 Vrelni kamenčki;
3.2.2.2.6 Lij ločnik, 250 ml;
3.2.2.2.7 Konusna bučka z ozkim grlom (erlenmajerica).
3.2.2.3 Reagenti.
3.2.2.3.1 Natrijev metilat, raztopina pripravljena z
raztapljanjem 1g natrija v 100 ml metanola, z
vsebnostjo manj kot 0,5% vode;
3.2.2.3.2 Vodikov klorid, približno 1N, brezvodna metanolna
raztopina, (glej pripombo pod 3.2.2.5 (a) in (b));
3.2.2.3.3 Heptan, za kromatografijo (Opombi 2 in 4);
3.2.2.3.4 Natrijev sulfat, brezvodni;
3.2.2.3.5 Dušik z vsebnostjo kisika manj kot 5 mg/kg plina.
3.2.2.4 Postopek s kislimi olji in maščobami.
Če olja vsebujejo kisline, ki imajo več kot dve dvojni vezi, se
priporoča odstranitev zraka iz metanola in bučke z nekaj minutnim
prepihovanjem z dušikom.
Vzorec pripravimo tako kot je opisano pod I, 1.2. 4 g (Opomba 5)
pripravljenega olja ali maščobe prenesemo v 250 ml konusno bučko
ali bučko z okroglim dnom.
Dodamo 40 ml raztopine natrijevega metilata (3.2.2.3.1), (glej
pripombo 3.2.2.5 (c)). Spojimo s povratnim hladilnikom in
segrejemo do vrenja. Raztopina se zbistri navadno po 10 minutah.
Reakcija je praktično končana v 15 minutah.
Dodamo ne manj kot 50 ml raztopine vodikovega klorida (3.2.2.3.2)
in nadaljujemo z vrenjem 10 minut. (glej pripombo po 3.2.2.5
(d)).
Ohladimo pod tekočo vodo, dodamo v bučko 100 ml vode, prenesemo
raztopino v 250 ml lij ločnik in dodamo 30 ml heptana (Opomba 4).
Dobro pretresemo in pustimo, da se sloja popolnoma ločita. Sloj
heptana ločimo. Vodni sloj ponovno ekstrahiramo s 30 ml heptana.
Združimo oba heptanska ekstrakta. Spiramo z vodo do nevtralne
reakcije. Ločimo in osušimo nad brezvodnim natrijevim sulfatom.
Filtriramo skozi bombažno vato v 100 ml erlenmajerico in, če je
potrebno, odparimo topilo do 20 ml na vodni kopeli pri
temperaturi vrenja v toku dušika (Opombi 6 in 7).
3.2.2.5 Pripombe
(a) V laboratoriju se lahko pripravijo majhne količine vodikovega
klorida na ta način, da se ga izžene iz komercialne raztopine
(1,18) s postopnim dodajanjem koncentrirane žveplove kisline
(npr. 1,84). Nastali plin se osuši na enostaven način s
prevajanjem skozi žveplovo kislino. Ker ima metanol veliko
afiniteto do vodikovega klorida, se priporoča velika previdnost
pri tej reakciji; na primer, plin se vodi skozi majhen obrnjen
lijak, ki se rahlo dotika površine metanola. Priporočljivo je
vnaprej pripraviti večje količine metanolne raztopine vodikovega
klorida, ki je stabilen v posodah, zaprtih z brušenim zamaškom,
če je hranjen v temi.
(b) Namesto metanolne raztopine vodikovega klorida se lahko
uporablja približno 1N raztopina žveplove kisline, vendar pri tem
esterifikacija traja najmanj 20 minut in oborjeni natrijev sulfat
ovira vrenje. Poleg tega je potrebno filtriranje ali uporaba
magnetnega mešalca.
(c) Lahko se pred vzorcem vlije 40 ml metanola in doda 0,4 g
natrija in tako sproti pripravi natrijev metilat.
(d) Glede na relativno veliko količino natrijevega metilata se
lahko v prisotnosti zelo kislih olj in maščob pojavi oborina
natrijevega klorida, kar lahko povzroča neenakomerno vrenje.
Oborina se sicer lahko odfiltrira, vendar ta operacija navadno ni
potrebna zaradi kratkega časa, ki je predviden za segrevanje.
4. Opombe
1. Če snovi, ki se ne saponificirajo, kasneje motijo, raztopino
po saponifikaciji razredčimo z vodo in te snovi ločimo na
običajen način z ekstrakcijo z dietil etrom, heksanom ali
petroletrom.
Milnato vodno raztopino nakisamo in odfiltriramo maščobne
kisline.
2. Določeni reagenti, posebno metanolna raztopina bor
trifluorida, lahko pri plinsko-kromatografskem določanju metil
estrov (v območju C20 - C22 iz metanolne raztopine bor
trifluorida) povzročajo lažne vrhove. Zato se mora vsaka nova
serija reagentov preveriti tako, da se pripravijo in
kromatografirajo metil estri čiste oleinske kisline. Različni
reagenti ne smejo povzročati vrhov, ki bi pri plinski
kromatografiji interferirali z vrhovi metil estrov maščobnih
kislin.
3. Če se metanolna raztopina bor trifluorida mora pripraviti iz
bor trifluorida v plinski obliki, postopamo na sledeči način:
Dvolitrsko bučko, v kateri se nahaja 1 liter metanola, ohladimo
na kopeli iz ledu in vode. V bučko, ki se nahaja v kopeli v
digestoriju, uvajamo skozi cekleno cev BF3 iz jeklenke, dokler ni
absorbirano 125 g plina. Da preprečimo vdor tekočine v regulator
plina, tok BF3 v cevi vzdržujemo pred potopitvijo v metanol in
dokler cevi ne izvlečemo iz raztopine. Plin iz bučke ne sme
izginiti prehitro, tako da bi nastale bele pare. Reagent je zelo
obstojen, rok uporabe je dve leti.
4. Heptan (mešanica čistih C7 izomer, preverjenih s plinsko
kromatografijo) lahko nadomestimo s heksanom, če niso prisotne
maščobne kisline z 20 ali več atomi ogljika.
5. Če zahtevane količine vzorca ni na voljo, lahko količino
vzorca zmanjšamo na 10 mg ali manj, s tem da se zagotovita
proporcionalno zmanjšanje volumnov reagentov in ustrezna velikost
opreme.
6. Metil estri se morajo po možnosti analizirati čim prej je
mogoče. Raztopina heptana, ki vsebuje metil estre se lahko, če je
potrebno, hrani v hladilniku pod inertno atmosfero. Priporočljivo
je, v primeru daljšega hranjenja, metil estre zaščititi pred
avtooksidacijo z dodatkom inhibitorja, ki ne moti nadaljnje
analize, npr. 0,005% (m/v) B.H.T. (di-ter.butil-2-6-metil-4-
fenol). Suhi metil estri, brez topila, se lahko, če je potrebno,
hranijo 24 ur v hladilniku pod inertno atmosfero, ali dalj časa v
evakuirani zataljeni cevki v napravi za globoko zmrzovanje.
7. Obstaja nevarnost izgube nekaterih hlapnejših metil estrov, če
je odparevanje topila predolgotrajno ali če je tok dušika
premočan. Za infra-rdečo spektrofotometrijo mora biti topilo čim
bolj odstranjeno. Za plinsko kromatografijo je bolje, da se
topilo ne odstrani popolnoma.
8. Pri oljih tipa ricinusovo olje bistrost ni kriterij reakcije.
III. PLINSKA KROMATOGRAFIJA METIL ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN
1. Splošno
Namen te metode je podati osnovna vodila za plinsko
kromatografsko določanje kvalitativne in kvantitativne sestave
mešanic metil estrov, dobljenih iz maščobnih kislin, kot je
opisano pod II. S to metodo se ne morejo analizirati
polimerizirane maščobne kisline. Navodila so uporabna za običajni
plinski kromatograf s polnjeno kolono in plamensko-ionizacijskim
detektorjem (Opomba 1).
2. Oprema
2.1 Plinski kromatograf
Primeren je vsak inštrument, katerega zmogljivost in resolucija
sta taka kot je opisano pod 4.1.2.
2.1.1 Injektor
Mrtev prostor injektorja mora biti čim manjši. Razen če lastnosti
materiala tega ne omejujejo, naj bi bila njegova temperatura 25
do 50 stopinj C višja od temperature kolone.
2.1.2 Peč
Peč mora omogočati segretje kolone do temperature najmanj 220
stopinj C in vzdrževanje te temperature znotraj 1 stopinje C.
Če se uporabljajo programirani pogoji, je priporočljivo izbrati
dvojni (twin) inštrument.
2.1.3 Kolone
2.1.3.1 Cevi
Morajo biti iz materiala, ki je odporen na analizirane maščobe in
olja, npr. steklene ali, če tega ni na voljo, iz nerjavečega
jekla (Opomba 2). Dolžina 1 do 3 m; relativno kratke kolone se
uporabljajo v prisotnosti kislin z dolgimi verigami (>C20).
Pri določanju C4 in C6 kislin je priporočljivo uporabiti 2 m
kolono.
Notranji premer 2 do 4 mm.
2.1.3.2 Polnitev
Nosilec: s kislino oprana in silanizirana diatomejska zemlja ali
kakršen koli inertni polnilec z ozkim razponom velikosti delcev
(25 mikro m med 125 in 200 mikro m), pri čemer je povprečna
vrednost odvisna od notranjega premera in dolžine kolone.
Stacionarna faza: polarna poliesterska faza (npr. polisukcinat
dietilenglikola, butan-di-ol poliadipat itd.) ali katerakoli
faza, ki je v skladu z zahtevami, določenimi v nadaljevanju (npr.
cianosilikoni itd.). Stopnja impregnacije med 5 in 20%. Za
nekatere separacije je uprabna nepolarna faza.
2.1.3.3 Kondicioniranje
Kolono, če je možno, ločimo od detektorja, zvišamo temperaturo
peči na 10 stopinj C nad delovno temperaturo in pri tej
temperaturi sveže pripravljeno kolono spiramo najmanj 16 ur s
tokom inertnega plina s hitrostjo 20 do 60 ml/min, nato pa še dve
uri pri 195 stopinj C.
2.1.4 Detektor
Detektor mora delovati pri temperaturi, ki je višja od
temperature peči.
Delovna navodila v tem postopku se nanašajo na plamensko-
ionizacijski detektor. (Opomba 1).
2.2 Injekcijska brizgalka
Naj ne bo večja od 10 mikro l, s skalo 0,1 mikro l.
2.3 Rekorder
Če se za izračunavanje sestave analizirane mešanice uporablja
rekorder, mora to biti visoko točna elektronska naprava,
združljiva z uporabljeno opremo:
- hitrost odgovora (response) manj kot 1,56 sekunde ali, še
boljše, 1 sekunda (hitrost odgovora je čas, ki ga pero rekorderja
uporabi za pot od 0 do 90%, kadar je 100% signal dodan v
trenutku);
- papir širine najmanj 25 cm;
- odvijanje papirja s hitrostjo 25 do 150 cm/h.
2.4 Integrator ali kalkulator (po posebni izbiri)
Če se uporablja elektronski integrator ali kalkulator, je
izračunavanje hitro in točno. Integrator mora biti linearen,
primerno občutljiv in korekcija odklona osnovne linije mora biti
zadovoljiva.
3. Reagenti
3.1 Nosilni plin: Katerikoli inertni plin (dušik, helij, argon
itd.), temeljito sušen, z vsebnostjo kisika manj kot 10
ppm;
3.2 Pomožni plin: vodik čistosti najmanj 99,9%, brez organskih
primesi oziroma zrak ali kisik brez organskih primesi;
3.3 Snovi za standardizacijo: mešanice metil estrov ali metil
estri iz olja znane sestave, podobnem, če je le mogoče,
analiziranemu olju ali masti.
4. Postopek
4.1 Priprava inštrumenta
4.1.1 Določitev optimalnih delovnih pogojev
Za določitev optimalnih delovnih pogojev je potrebno upoštevati
naslednje spremenljivke:
dolžina in premer kolon;
vrsta in količina stacionarne faze;
temperatura kolone;
hitrost pretoka nosilnega plina;
želena resolucija;
količina vzorca;
trajanje analize.
Količino vzorca moramo izbrati tako, da z detektojem in
elektrometrom dobimo linearnost. Na splošno so vrednosti, s
katerimi dobimo željene rezultate, to je število teoretičnih
platojev v primeru metil stearata, enako ali ne manjše od 2000 in
eluiranje končano v približno 15 minutah, naslednje:
Notranji premer kolone (mm) Hitrost pretoka nosilnega plina
(ml/min)
2 15-25
3 20-40
4 40-60
Koncentracija sekundarne faze Temperatura (stopinj C)
(%)
5 175
10 180
15 185
20 185
Če inštrument to omogoča, mora imeti injektor temperaturo blizu
200 stopinj C, detektor pa mora imeti enako ali višjo
temperaturo kot peč.
Skozi plamensko-ionizacijski detektor teče vodik s polovično
hitrostjo nosilnega plina in kisik 5- do 10- krat hitreje kot
vodik.
4.1.2 Določitev učinkovitosti in ločljivosti
Analiziramo mešanico metil stearata in oleata v približno enakem
razmerju (npr. metil ester iz kakavovega masla). Količina vzorca,
temperatura kolone in hitrost pretoka nosilnega plina morajo biti
izbrani tako, da se maksimum vrha metil stearata zabeleži v
približno 15 minutah po vrhu topila in da je vrh, ki ga
opazujemo, enak približno trem četrtinam celotne skale. Po
naslednji formuli izračunamo
n, število teoretičnih platojev (učinkovitost):
dR(1) 2
n = 16 ( ------- )
omega 1
in R, ločljivost:
2 Delta
R = -----------------
omega 1 + omega 2
kjer je:
dR(1) retenzijska razdalja od injiciranja do relativnega
maksimuma vrha metil stearata, merjena v mm
omega 1 in omega 2 sta širini vrhov metil starata in oleata,
merjeni v mm med točkama, kjer tangenti na točkah prelomov
krivulj sekajo osnovno črto.
Delta je razdalja med relativnima maksimuma vrhov metil
starata in oleata.
Sprejeti delovni pogoji morajo biti takšni, da za metil stearat
dobimo število, enako ali večje kot 2000 teoretičnih platojev in
ločljivost, ki ni manjša od 1:2,5. Morajo tudi omogočiti
ločevanje linolejske kisline (C18:3) od arašidove (C20:0) in
gadoleinske kisline (C20:1).
4.2 Analiza
Za analizo uporabimo 0,1 do 2 ml raztopine estrov v heptanu,
dobljene po postopku, opisanem pod II. Če so estri neraztopljeni,
pripravimo 10% raztopino v heptanu in injiciramo 0,1 do 1 ml te
raztopine.
V nekaterih primerih lahko za analizo uporabimo tudi večjo
količino vzorca (do 10-krat); pri tem moramo upoštevati pogoje za
identifikacijo sestavin, prisotnih v sledovih, kot so opisani pod
4.1.1. Vendar je analizo mogoče izvajati pri nižjih temperaturah
peči, kadar je potrebno določiti maščobne kisline pod C12, ali
pri višjih temperaturah, kadar je potrebno določiti maščobne
kisline s številom ogljikovih atomov nad C20.
V obeh primerih se lahko analiza izvaja s programiranimi
temperaturami. Na primer, če vzorec vsebuje metil estre maščobnih
kislin z manj kot 12 atomi ogljika, injiciramo vzorec pri 100
stopinjah C (ali pri 50 do 60 stopinjah C, če je prisotna maslena
kislina) in takoj nato programiramo s 4 do 8 stopinjami C/min do
optimalne temperature.
V nekaterih primerih je možno združiti oba procesa, to je
nadaljujemo eluiranje pri stalni temperaturi po intervalu
programiranja temperature, dokler niso vse sestavine eluirane. Če
inštrument ne more delovati s programom za temperaturo, se
analiza izvaja pri dveh izbranih temperaturah med 100 in 195
stopinj C.
Kjer je potrebno, je zaželjeno izvajati analizo na dveh določenih
fazah nasprotne polarnosti, da bi se preverila odsotnost skritih
vrhov, na primer pri ribjem olju ali če so istočasno prisotne
konjugirane vezi C18:3 in C20:0 ali C18.3 in C18:2.
5. Izražanje rezultatov
5.1 Kvalitativna analiza
Pri identičnih pogojih kot pri izvedbi analize, analiziramo
referenčno mešanico in določimo retenzijske razdalje (ali
retenzijske čase) za maščobne kisline, ki sestavljajo mešanico.
Narišemo diagram logaritem retenzijske razdalje (ali
retenzijskega časa) v odvisnosti od števila ogljikovih atomov.
Diagrami, narisani pod izotermalnimi pogoji in za estre z ravnimi
verigami ali določeno stopnjo nenasičenosti, morajo na
semilogaritemskem papirju izgledati kot vzporedne linearne
premice.
Kromatografske vrhove identificiramo tako, da jih primerjamo s
premicami, ali če je potrebno z interpolacijo.
Nujno je, da izključno takšne pogoje izvedbe, da lahko obstajajo
"maskirani vrhovi", to je, da se dve sestavini ne moreta ločiti
zaradi neprimerne ločljivosti.
5.2 Kvantitativna analiza
5.2.1 Določanje sestave
Uporabljamo (razen v izjemnih primerih) metodo internega
standarda, to je predpostavljamo, da so vse sestavine, prisotne v
vzorcu, zbrane v kromatogramu in da je vsota površin pod vrhovi
enaka 100% vsebnosti (popolno eluiranje).
Če je inštrument opremljen z integratorjem, uporabljamo tako
dobljene rezultate. Če ni, določimo površino pod vsakim vrhom z
metodo trikotnika tako, da množimo njegovo višino s širino na
polovici višine in pri tem, če je potrebno, upoštevamo med
beleženjem uporabljene atenuacije.
5.2.1.1 Splošni primer
Če pomembne komponente pod C8 niso prisotne, izračunamo za vsako
sestavino njeno vsebnost, kot odstotek metil estra, ki ga
določimo tako, da je odstotek enak površini odgovarjajočega vrha
deljeni z vsoto vseh površin vrhov:
odstotek (m/m) spojine i, A(i)
izražene kot metil ester = ------------ x 100
Sigma A(i)
kjer je:
A(i) = površina vrha spojine i;
Sigma A(i) = vsota površin vseh vrhov.
5.2.1.2 Uporaba korekcijskih faktorjev
Včasih je za preračun odstotka površine vrha v masni odstotek
sestavine potrebno uporabiti korekcijske faktorje, posebno če so
prisotne kisline pod C8 ali kisline s sekundarnimi skupinami, ali
pri uporabi detektorjev s toplotno prevodnostjo (katarometri).
Korekcijske faktorje izračunamo iz kromatograma, dobljenega z
referenčno mešanico metil estrov točno znane koncentracije pri
identičnih pogojih.
Za referenčno mešanico:
B(i)
odstotek (m/m) spojine i = ------------ x 100
Sigma B(i)
kjer je:
B(i) = masa spojine i v referenčni mešanici;
vsota B(i) = vsota mas različnih sestavin v referenčni mešanici.
Iz kromatograma, dobljenega z referenčno mešanico, lahko
izračunamo:
C(i)
odstotek (površina/površina) spojine i = ------------ x 100
Sigma C(i)
kjer je:
C(i) = površina vrha, ki odgovarja spojini i;
vsota C(i) = vsota površin vseh vrhov.
Iz tega sledi:
B(i) x Sigma C(i)
korekcijski faktor K(i) = -------------------
C(i) x Sigma B(i)
Običajno se korekcijski faktor izrazi kot K16 = 1 in relativni
faktorji postanejo:
K i
K' i = ------
K 16
Pri vzorcu se vsebnost vsake sestavine poda kot:
K'i x A(i)
odstotek (m/m) spojine i = ------------------- x 100
vsota (K'i x A(i))
izražene kot metil ester.
5.2.1.3 Uporaba internega standarda
V nekaterih primerih (posebno pri določanju kislin C4 in C6 in
pri določanju kislin, pri katerih se ne eluirajo vse maščobne
kisline) je potrebno uporabiti interni standard. V takem primeru
določimo korekcijski faktor po formuli:
m(s) x K'i x A(i)
odstotek (m/m) spojine i = ------------------- x 100
m x K's x A(s)
izražene kot metil ester,
kjer je:
m(s) = masa internega standarda v mg;
m = masa vzorca v mg;
K's = korekcijski faktor internega standarda;
A(s) = površina vrha internega standarda;
A(i) = površina vrha spojine i.
5.2.2 Izražanje rezultatov
Rezultati se podajo na:
tri signifikantne (značilne) številke pri vsebnosti več kot 10%;
dve signifikantni številki pri vsebnosti med 1 in 10%;
eno signifikantno številko pri vsebnosti pod 1%;
pri čemer je ena številka mišljena za decimalno vejico.
5.2.3 Ponovljivost
Razlika med rezultatoma dveh določanj, izvedenih istega dne, na
istem inštrumentu, z istim izvajalcem in z istim estrom, pri
sestavini, prisotni z vsebnostjo nad 5%, ne sme presegati 3%
relativno glede na določeno vrednost. Absolutna vrednost ne sme
presegati 1%. V primeru sestavin, prisotnih pod 5%, ponovljivost
s koncentracijo naglo pada.
5.2.4 Obnovljivost
Razlika med rezultatoma, dobljenima v dveh različnih
laboratorijih pri sestavini, prisotni z vsebnostjo nad 5%, ne sme
presegati 10% relativne vrednosti glede na določeno vrednost.
Absolutna vrednost ne sme presegati 3%. V primeru sestavin,
prisotnih pod 5%, ponovljivost s koncentracijo naglo pada.
6. Opombe
1. Lahko se uporablja tudi kromatograf z detektorjem na principu
toplotne prevodnosti (katarometer). V takem primeru morajo biti
opisani pogoji modificirani na sledeči način:
Kolona: dolžina dva do štiri metre, notranji
premer 4 mm;
Nosilec: velikost delcev v območju od 160 do 200
mm;
Stopnja impregnacije: 5 do 25%;
Nosilni plin: helij ali, če tega ni na voljo, vodik z
najnižjo možno vsebnostjo kisika.
Nobenega pomožnega plina;
Temperatura injektorja: 40 do 60 stopinj C višja od temperature
peči;
Temperatura kolone: v območju od 180 do 200 stopinj C;
Pretok nosilnega plina: običajno v območju 60 do 80 ml/min;
Injicirane količine: običajno v območju 0,5 do 2 ml.
Pri kvantitativni analizi moramo upoštevati korekcijske faktorje
kot so opisani pod 5.2.1.2.
2. Če so prisotne sestavine z več kot tremi dvojnimi vezmi, se
lahko zgodi, da cevi iz nerjavečega jekla povzročijo njihovo
razgradnjo.
IV. DOLOČANJE ERUKA KISLINE PRI VSEBNOSTI NAD 5%
1. Namen in področje uporabe
S to metodo določamo vsebnost eruka kisline v:
(i) oljih in maščobah, ki vsebujejo katoleinsko kislino
(posebna izomera cis-dokozenojske kisline, ki se
pojavlja v ribjih oljih);
(ii) hidrogeniranih oljih in maščobah, ki vsebujejo
trans in cis-izomere dokozenojske kisline.
2. Definicija
Vsebnost eruka kisline je: vsebnost eruka kisline, kot
je določena z opisano metodo.
3. Princip
Metil estre maščobnih kislin iz olj ali maščob ločimo z
nizkotemperaturno srebro-nitratno tankoplastno
kromatografijo in jih kvantitativno določimo s plinsko-
tekočinsko kromatografijo.
4. Reagenti
4.1 Dietileter, brez peroksida, sveže destiliran;
4.2 n-heksan;
4.3 Silika gel G, za tankoplastno kromatografijo;
4.4 Silika gel, za kolonsko kromatografijo;
4.5 Srebrov nitrat, raztopina 200 g/l. 24 g srebrovega
nitrata raztopimo v vodi in razredčimo z vodo
do 120 ml;
4.6 Metil erukat, raztopina 5 mg/ml. 50 g metil erukata
raztopimo v nekaj ml n-heksana in razredčimo do
10 ml z n-heksanom;
4.7 Metil tetrakozanoat, raztopina, interni standard, 0,25
mg/ml. 25 g metil tetrakozanoata raztopimo v nekaj
ml n-heksana (kot 4.6) in razredčimo z n-heksanom do 100
ml;
4.8 Topilo za razvijanje: toluen: n-heksan 90: 10 (v/v);
4.9 2.7 diklorofluorescein, raztopina 0,5 g/l. Med segrevanjem
in mešanjem raztopimo 50 mg 2,7
diklorofluoresceina v 100 ml 50% vodnega metanola.
5. Oprema
5.1 Aparatura za tankoplastno kromatografijo, sestavljena
iz:
5.1.1 Naprave za globoko zmrzovanje, ki lahko vzdržuje posodo
za razvijanje in vsebino pri temperaturi -20 do -25
stopinj C;
5.1.2 Steklene ploščice, 200 x 200 mm;
5.1.3 Svetilka z ultravijoličnim svetlobnim izvorom;
5.1.4 Steklene kolone, dolžine približno 200 mm, notranji
premer približno 10 mm, s filtrom iz steklene volne ali
sintranega stekla. Alternativno se lahko uporabijo
majhni lijaki s filtri iz sintranega stekla;
5.1.5 Aplikator, za nanašanje raztopine v obliki ozkega pasu
ali proge na ploščice za tankoplastno kromatografijo.
5.2 Plinsko-tekočinski kromatograf, z elektronskim
integratorjem, kot je opisan v III, 3.1.
6. Postopek
6.1 Priprava metil estrov maščobnih kislin
Približno 400 mg oljne ali maščobne komponente vzorca za
analizo raztopimo po metodi, opisani v II.3 tako, da
dobimo raztopino 20 do 50 mg/ml metil estra maščobne
kisline v n-heksanu.
6.2 Tankoplastna kromatografija
6.2.1 Priprava ploščic
60 g silikagela (4.3) prenesemo v 500 ml bučko z
okroglim dnom, dodamo 120 ml raztopine srebrovega
nitrata (4.5) in stresamo eno minuto, da dobimo
popolnoma homogeno suspenzijo. Suspenzijo nanesemo
na običajen način na ploščice, debelina sloja naj bi
bila približno 0,5 mm. S to količino suspenzije lahko
pripravimo pet ploščic 200 x 200 mm.
Ploščice delno posušimo na zraku (najbolje v temi
približno 30 minut). Nato jih popolnoma posušimo in
aktiviramo v sušilniku pri 100 stopinjah C dve uri in 30
minut. Ploščice moramo po aktiviranju uporabiti čimprej,
sicer pa jih moramo hraniti v temi in pred uporabo
ponovno aktivirati. (Opomba: zadovoljivo aktiviranje
dosežemo pri 110 stopinjah C pod pogojem, da pri tem
ploščice ne potemnijo). Da med razvijanjem preprečimo
učinke robov, pred uporabo napravimo na sloju zarezo,
oddaljeno od stranskih robov in zgornjega roba 10 mm.
6.2.2 Nanašanje metil estrov
S pomočjo aplikatorja (5.1.5) nanesemo 50 ml raztopine metil
estrov (6.1), pripravljenih iz vzorca, v obliki približno
50 mm dolgega ozkega traku, na razdalji najmanj 40 mm od
stranskih robov in 10 mm od spodnjega roba ploščice. Na podoben
način nanesemo 100 mikro l raztopine, pripravljene iz enakih
volumskih delov raztopine metil estrov (6.1) in raztopine metil
erukata (4.6). Med nanašanjem raztopin moramo biti posebno
pozorni na krhko naravo sloja. (Opomba: kot pomoč pri
identifikaciji traku metil erukata po razvijanju lahko nanesemo
na ploščico 50 ml raztopine metil erukata (4.6) - glej sliko). Po
nanosu metil estrov postavimo spodnji rob ploščice v dietileter,
dokler eter ne doseže višine približno 5 mm nad nanosom vzorca. S
tem se metil estri koncentrirajo v obliki ozkega traku.
6.2.3 Razvijanje ploščic
V posodo za razvijanje nalijemo topilo za razvijanje (4.8) do
globine približno 5 mm in posodo, skupaj s pokrovom, postavimo v
napravo za globoko zmrzovanje (5.1.1) v kateri je temperatura -25
stopinj C ali čim bližja tej. (V nekaterih primerih se priporoča
nihanje posode za razvijanje). Po dveh urah previdno postavimo
ploščico v posodo za razvijanje in počakamo, da se topilo dvigne
do približno 1/2 do 2/3 višine ploščice. Ploščico odstranimo in
topilo previdno uparimo v rahlem toku dušika. Ploščico ponovno
postavimo v posodo za razvijanje in počakamo, da se topilo dvigne
do višine ploščice. Ploščico odstranimo in ponovno posušimo v
toku dušika, nato pa po njej previdno razpršimo raztopino 2,7
diklorfluoresceina (4.9).
Ploščico opazujemo pod ultravijolično svetlobo, lociramo trak, ki
vsebuje metil erukat iz vzorca in ga primerjamo z intenziviranim
trakom vzorca, ki mu je bil dodan metil erukat (glej sliko).
6.2.4 Ločevanje frakcij metil estrov
Sloj metil erukata, dobljenega iz vzorca, prenesemo v 50 ml čašo
in pri tem pazimo, da ne nastanejo izgube. Na enak način
prenesemo v drugo 50 ml čašo silikagel, ki se nahaja nad in pod
slojem metil erukata. Ta sloj vsebuje vse frakcije ostalih metil
estrov maščobnih kislin. V obe čaši dodamo po 1,0 ml standardne
raztopine metil tetrakozanoata (4.7) in po
10 ml dietiletra (4.1). Premešamo in prenesemo vsebino iz čaš v
kolone ali lijake (5.1.4), v katerih se nahaja približno 1 g
silikagela (4.4); metil estre eluiramo s tremi ali štirimi 10 ml
porcijami dietil etra. Filtrate zbiramo v majhnih bučkah. Oba
filtrata uparimo do majhnega volumna v blagem toku dušika in
prenesemo metil estre v majhne steklene epruvete s konusnim dnom.
V rahlem toku dušika odstranimo topilo tako, da se metil estri
skoncentrirajo na dnu epruvet. Metil estre raztopimo v približno
25 do 30 mikro l n-heksana (4.2).
6.3 Plinsko-tekočinska kromatografija
6.3.1 Po postopku, opisanem v III., 4 analiziramo 1 do 2 ml
raztopine metil estrov, dobljenih iz (i) frakcije, ki
vsebuje metil erukat in (ii) frakcije, ki vsebuje ostale
metilirane maščobne kisline.
6.3.2 Iz elektronskega integratorja dobimo naslednja območja
vrhov:
(i) iz kromatograma frakcije, ki vsebuje metil erukat:
(a) metil erukat (E)
(b) interni standard (L1)
(c) celotna območja površin vrhov metilh estrov brez
internega standarda (EF)
(ii) iz kromatograma frakcij, ki vsebujejo estre ostalih
maščobnih kislin:
(a) celotne območja površin vrhov metilh estrov brez
internega standarda (RF)
(b) interni standard (L2).
7. Podajanje rezultatov
7.1 Metoda izračuna in formula
7.1.1 Vsebnost eruka kisline v vzorcu, izražena v obliki metil
estra kot odstotek glede na skupno vsebnost metil
estrov, pripravljenih iz vzorca, je podana z:
E
-------------- x 100
EF RF
L1 ( -- + --)
L1 L2
kjer so:
E, EF, RF, L1 in L2 površine vrhov iz 6.3.2, po potrebi
korigirane s pomočjo kalibracijskih faktorjev.
V praksi je vrednost metil erukata, podana z zgoraj navedeno
formulo, enaka vsebnosti eruka kisline, izražene kot odstotek
glede na skupno vsebnost maščobnih kislin v vzorcu.
7.1.2 Če so površine vrhov dobljene v odstotkih, se vrednosti EF
in RF lahko izračunajo po formuli:
EF = 100 - L1
RF = 100 - L2
7.1.3 Metoda izračuna (7.1.1) predpostavlja, da je vsebnost
tetrakozanojske kisline v vzorcu zanemarljiva. Če se izkaže, da
so v vzorcu prisotne značilne vsebnosti te kisline, se mora
vrednost za tetrakozanojsko kislino (L2), dobljena iz
kromatograma frakcij, ki vsebujejo metil estre ostalih maščobnih
kislin, zmanjšati na:
L2 - T2
kjer je:
T0P0
T2 = ----
P0
in:
T2 = površina vrha metil tetrakozanoata, dobljenega iz vzorca,
ki tvori del površine vrha, pripisane internemu
standardu v kromatogramu frakcij metil estrov ostalih
maščobnih kislin
P2 = površina vrha metil palmitata, dobljenega iz kromatograma
ostale frakcije
T0 = površina vrha metil tetrakozanoata, dobljena iz
kromatograma metil estrov skupnih maščobnih kislin
P0 = površina vrha metil palmitata, dobljena iz kromatograma
metil estrov maščobnih kislin, določenih po metodi iz III.
4.
7.1.4 Izpeljava formule
Delež maščobnih kislin v frakciji, ki vsebuje metil erukat,
izražen kot odstotek skupnih maščobnih kislin v vzorcu, je podan
z:
EF
--
L1 EF
------------ x 100 ali -------------- X 100
EF RF EF RF
-- + -- L1 ( -- + -- )
L1 L2 L1 L2
Delež eruka kisline v frakciji, ki vsebuje metil erukat, je podan
z:
E
--
EF
Iz tega sledi, da je vsebnost eruka kisline v vzorcu, izražena
kot odstotek glede na skupno vsebnost maščobnih kislin, podana z:
EF E E
-------------- x -- x 100 ali -------------- x 100
EF RF EF EF RF
L1 ( -- + -- ) L1 ( -- + -- )
L1 L2 L1 L2
7.1.5 Ponovljivost
Razlika med vrednostima dveh določanj, ki se izvajata istočasno
ali drugo za drugim na istem vzorcu, z istim analitikom, pod
enakimi pogoji, ne sme presegati 10% rezultata ali 0,5 g na 100 g
vzorca, upoštevajoč večjo vrednost.
SLIKA
Značilen tankoplastni kromatogram, ki prikazuje ločevanje metil
estrov eruka kisline, katoleinske kisline in trans-izomere
dokozenojske kisline
